本发明专利技术公开了一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1 Step Buffer 12.5-25微升，RNase Free H2O 7.5-15微升，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1-2微升，2×GC Buffer 12.5-25微升，10mmol/L dNTPs 1-2微升，Taq DNA聚合酶1.0微升，阳性对照；Part2：Solution A 200-400微升，Solution B 75-150微升，Rinse A 500-1000微升，Rinse B 800-1600微升，Elution Buffer 50-10微升，Spin Column 1支，Collection Tube 2支，薄壁PCR管1支，上样缓冲液1-2微升。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
猪痕（ClassicalSwineFever，CSF)是由猪痕病毒（ClassicalSwineFever Virus，CSFV)引起猪的一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病，对养猪业危害十分 严重，是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病，也是国际兽疫局（0IE)列为16 种A类法定传染病之一。CSFV为正链RNA病毒，全基因组长12. 5kb左右，在分类学地位上 为黄病毒科，猪瘟弱毒疫苗在中国的大规模应用，使猪瘟野毒感染和疫苗接种的区分变得 非常困难但又十分必要。伪狂犬病（pseudorabies，PR)又称Aujeszky氏病，是由伪狂犬 病病毒（pseudorabiesvirus,PRV)引起的多种家畜（猪、牛、羊等）和野生动物以发热、奇 痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病，该病属于典型且极难防疫的自然 疫源性疾病之一，PRV属于疤疹病毒目疤疹病毒科基因组大小约150kb。目前，猪瘟和伪狂 犬病已被列入《国家中长期动物疫病防治规划》（2012- 2020年）重点优先防治的疫病，其 控制目标是：到2015年原种猪场达到净化标准，到2020年全国所有种猪场达到净化标准。 因此，亟待需要建立一种快速、高效、敏感、特异且同时能鉴别CSF和PR疫苗毒与野毒mPCR 方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测 试剂盒及其使用方法，能快捷有效地一次性区分CSF与PR弱毒免疫猪和野毒感染猪。 本专利技术的技术方案是：一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒，包含 Parti和Part2, Parti :2X1 Step Buffer 12. 5-25微升，RNase Free H20 7. 5-15微升， PrimeScript One Step Enzyme Mix 1-2微升，阳性对照；Part2 :SolutionA200-400微 升，Solution B 75-150微升，RinseA500-1000微升，Rinse B 800-1600微升，Elution Buffer 50-10微升，Spin Column 1支，Collection Tube 2支，薄壁PCR管1支，上样缓冲 液1-2微升。 Part 1零下20 °C保存，Part2室温保存。 -步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒的使用方法，包含以下步骤： (1) 取病料样本，加入离心管中；后加入SolutionA，振荡混匀后，室温放置； (2) 加入SolutionB，混合均匀后，室温放置，后离心；将上清液转移到l#Collection Tube中，加异丙醇和冰乙酸混匀； (3) 将SpinColumn安置于2#CollectionTube上；将步骤（2)的上清液转移至Spin Column中，离心，弃滤液； (4) 将RinseA加入至上述SpinColumn中，室温静置，离心，弃滤液； (5) 将RinseB加入至SpinColumn中，离心，弃滤液；再次离心； (6) 将SpinColumn安置于离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入灭菌蒸馏水或 ElutionBuffer，室温静置；离心，洗脱病毒RNA/DNA，得到病料模板； (7) mPCR扩增：2XIStepBuffer、PrimeScriptOneStepEnzymeMix、CSFV野毒 上下游引物、CSFV疫苗毒上下游引物、上述病料模板和RNaseFreeH20进行PCR扩增反应； (8) 取PCR产物及阳性对照分别与上样缓冲液混合均匀后，于1XTAE琼脂糖凝胶中电 泳检测，紫外灯下观察结果，即可。 首次使用前，在RinseA中添加12. 5mL的100%乙醇；在RinseB中添加31. 5mL 的100%乙醇。CSFV野毒上下游引物： F1 :5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'， R1 :5' -GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'，片段 649bp。 CSFV疫苗毒上下游引物： F2 :5,-ACTCGGGGCCTGGACTAGACA-3,， R2 :5' -CGCCGAAAAAAGAAAAAAAAGAA-3'，片段 378bp。PRVTK基因上下游引物： F3 :5,-TGGCGTACTGGCGCACTCTGTT-3,， R3 :5' -TGATGTCCCCGACGATGAAGCG-3'，片段 282bp。PRVgB基因上下游引物： F4 :5'-AGGCCATCGACGCCATCTACCA-3'， R4 :5' -TGGAGTTCTGCACGTACACGCC-3'，片段 549bp。 PRVgE基因上下游引物： F5 :5'-GCGAGAACTTTACCGCCACGCT-3'， R5 :5' -TCGTCCTCGTCGCTGCTGAACT-3'，片段 829bp。 本专利技术的有益效果：现有的利用PCR检测和诊断的方法较多，且只能单一检测出 存在猪瘟或猪伪狂犬病毒感染，但不能区别是否为接种猪瘟或猪伪狂犬病免疫和自然野毒 所引起的感染；该多重PCR方法可一步同时区分猪瘟或猪伪狂犬病疫苗免疫猪和野毒感染 猪的鉴别，为首创。【附图说明】图1为鉴别猪瘟野毒与疫苗毒二重PCR方法特异性检测结果；M:DL1000marker; 1:CSF野毒与疫苗毒PCR产物；2:CSF野毒PCR产物；3:CSF疫苗毒PCR产物；4 :PCV2PCR 产物；5:PRRSVPCR产物；6:PRVPCR产物；7 :E.coliPCR产物； 图2为鉴别猪伪狂犬野毒与疫苗毒三重PCR方法特异性检测结果；M.DLlOOOmarker; 1 :阴性对照；2:PRVGuizhou-DYPCR产物；3 :Bartha-K61 株PCR产物；4 :SA215 株PCR产 物；5 :PCV2PCR产物；6:PRRSVPCR产物；7:CSFVPCR产物；8 :E.coliPCR产物； 图3、表1分别为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法退火温度优化检测结 果与其引物浓度配比量对应结果；M:DL1000DNAmarker;1-5 :不同引物浓度mPCR检测结 果； 图4为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法总体系优化检测结果；M.DL1000marker;1 :100yL反应体系；2:50yL反应体系；3:30yL反应体系；4:25yL 反应体系； 图5为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法退火温度优化检测结果；(M1，M2)DL(2000,1000)DNAmarker；1 ：61°C；2 ：60, 5 〇C；3：59. 6 〇C；4：58. 3 〇C；5：56. 7°C； 6 ：55. 3°C；7 ：54. 5°C；8 ：54°C； 图6为鉴别猪瘟和猪伪狂犬野毒与疫苗毒五重PCR方法敏感性试验检测结果；(Ml，M2).DL(1000,2000)DNAmarker;1 :5°稀释；2 :5 1 稀释；3 :5 2稀释；4 :5 3稀释；5 :5 4稀 释；6 :5 5稀释；7 :5 6稀释；8 :6 7稀本文档来自技高网...
【技术保护点】
一步法猪瘟与猪伪狂犬mPCR强弱毒鉴别检测试剂盒，其特征在于：包含Part1和Part2，Part1：2×1 Step Buffer 12.5‑25微升，RNase Free H2O 7.5‑15微升，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1‑2微升，2×GC Buffer 12.5‑25 微升，10mmol/L dNTPs 1‑2 微升，Taq DNA聚合酶1.0微升，阳性对照；Part2：Solution A 200‑400微升，Solution B 75‑150微升，Rinse A 500‑1000微升，Rinse B 800‑1600微升，Elution Buffer 50‑10微升，Spin Column 1支，Collection Tube 2支，薄壁PCR管 1支，上样缓冲液1‑2微升。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤德元，李达，马萍，曾智勇，刘霞，唐宇，方英，王洪光，韦冠东，
申请(专利权)人：贵州大学，贵州省动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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