一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用制造技术

本发明专利技术公开一株能裂解NDM‑1阳性肺炎克雷伯氏菌临床分离菌的强裂解性噬菌体及其作为生物制剂在防治NDM‑1肺炎克雷伯氏菌引发的感染和污染中的应用，该噬菌体保藏号为CCTCC M 2015760，具有正二十面体的头部和可伸缩的尾部，属于肌尾科双链DNA噬菌体；该噬菌体具有较强的杀灭活性和较宽的噬菌裂解谱，可用于制备防治由NDM‑1阳性肺炎克雷伯氏菌引起的细菌感染的药物，以及杀灭养殖环境和医疗环境中的NDM‑1阳性肺炎克雷伯氏菌。

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体及其应用
本专利技术涉及生物工程领域，特别是一株肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_he1(klebsiellapeneumoniaephagevB_KpnM_he1)及其应用。
技术介绍
克雷伯氏菌属(Klebsiella)为肠杆菌科中一类有荚膜的革兰氏阴性杆菌，其中肺炎克雷伯氏菌(又称肺炎杆菌)、臭鼻克雷伯氏杆菌和鼻硬结克雷伯氏菌与人类关系密切，特别是肺炎克雷伯氏菌，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上，为呼吸道感染的重要病原体，常引起重症肺炎，还可引起泌尿道感染、胆道感染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)广泛分布于自然界的土壤、水和农产品及林产品中，在人和动物的肠道及呼吸道内也常见，是典型的条件致病菌，常于动物抵抗力下降时引起暴发性流行，如奶牛的乳房炎、家兔的肠炎、肺炎，雏鸡腹泻，绵羊的传染性口炎，大熊猫的腹泻、肝炎，猪腹泻，貂肺炎和豚鼠肺炎等。以奶牛为例，肺炎克雷伯氏菌感染可引起奶牛乳房炎，造成产奶量下降，牛奶品质降低，而且病原菌还具有通过食物链(奶产品)传递给人类的风险，从而对人类健康造成潜在危害。青霉素类、头孢类和碳青霉烯类等β-内酰胺类药物是防治肺炎克雷伯氏菌感染最主要的药物，其中青霉素类和头孢类药物在治疗肺炎克雷伯氏菌感染中广泛使用，但由于长期的药物选择性压力，病原菌表现出了对这些药物严重的耐药性。NDM-1基因为新德里金属β-内酰胺酶基因，该基因编码的蛋白为一种水解酶，可以水解几乎所有的β-内酰胺类药物，并且携带NDM-1基因的细菌一般同时携带其它种类的耐药基因，表现出对多种药物的耐药性(Multi-drugresistance)，因此，含有NDM-1基因的细菌被称为“超级细菌”。肺炎克雷伯氏菌本身就是一种重要的人兽共患性细菌，而携带NDM-1基因的肺炎克雷伯氏菌(如2015年浙江省首次检出1株携带NDM-1基因的肺炎克雷伯氏菌《中国人兽共患病学报》)能够对人医临床上使用的β-内酰胺类药物产生耐药性，导致临床治疗的失败。目前人医临床上针对NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的感染，主要采取的治疗措施仍是抗生素疗法，即选择对该菌敏感的非β-内酰胺类药物进行治疗，但是抗生素长期使用亦可能激发或诱导病原菌的进一步超乎人类想象的变异，产生更为可怕的“超级耐药细菌”(Superbugs)，因此，寻找一种有效的抗生素替代疗法成为摆在全球科学工作者面前的重要科学问题。噬菌体是一种杀灭细菌的病毒，寄生于细菌并利用细菌来复制繁殖，最后将细菌裂解死亡，由于其天然的杀菌特性，而被科学家认为是潜在的“超级细菌的有效克星”，而噬菌体对宿主细菌的特异性高、强大的裂解能力以及对人类和动物(产品)没有毒副作用、不会产生药物残留等优势而显示出了比抗生素更加广阔的应用前景和价值。噬菌体制剂的研制开发和应用无疑是解决这一问题的理想方法，在噬菌体产品开发方面，东欧一些国家已经批准某些噬菌体产品应用于人类皮肤金葡菌感染的治疗，美国也批准某些产品应用于动物性食品的表面消毒，如2006年美国FDA批准李斯特噬菌体制剂在禽产品和芝士上应用，用于消毒。吉林大学2013年公开了一株NDM-1肺炎克雷伯氏菌的噬菌体(路荣，《NDM-1肺炎克雷伯氏菌裂解性噬菌体的分离鉴定及其对小鼠菌血症的治疗研究》，硕士论文，2013.6)，路荣公开的噬菌体NKP-1是用ATCCBAA-2146(美国ATCC保藏中心)为宿主分离的，噬菌体NKP-1裂解谱很窄，仅能裂解ATCCBAA-2146宿主菌，这就限制了该噬菌体的进一步应用。另有，吉林大学的逯茵茵(逯茵茵，《肺炎克雷伯氏菌裂解性噬菌体的分离和鉴定》，硕士论文，2015.6)公开的噬菌体和其中属于长尾科病毒，属于足尾科病毒，而属于滴状病毒，与本专利技术发现的病毒外观形状差异迥异，不属于同一类噬菌体。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种能裂解肺炎克雷伯氏菌的噬菌体vB_KpnM_he1，该噬菌体具有较宽的裂解谱，不仅可以裂解NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌，也可以裂解不携带NDM-1的肺炎克雷伯氏菌，既可以裂解标准菌株ATCCBAA-2146，也可以裂解从乳房炎牛奶和奶牛粪便中分离的肺炎克雷伯氏菌临床株，可以单独或与其他物质复配使用，为消毒净化环境提供一种安全、无毒的噬菌体产品，本专利技术是这样实现的：一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体，所述噬菌体保藏号为CCTCCNo:M2015760，申请人将该噬菌体自命名为vB_KpnM_he1。该噬菌体具有呈正二十面体的头部和可伸缩的尾部；噬菌体在固体培养基上可以形成透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，直径为1-2mm；基因组核酸的酶切图谱显示该噬菌体核酸是双链DNA(dsDNA)；根据国际病毒分类委员会(ICTV)2005年发表的《病毒分类—国际病毒分类委员会第八次报告》，vB_KpnM_he1属于肌尾病毒科(Myoviridae)。该噬菌体在30-70℃中放置60min，活性稳定，在80℃中则失活；处于pH5.0-10.0时，其效价与初始效价无显著性差异。本专利技术所述保藏号为CCTCCNo:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防治NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用。本专利技术所述保藏号为CCTCCNo:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌中的应用。进一步，本专利技术所述保藏号为CCTCCNo:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防治NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用，所述药物剂型为粉剂或液体剂型。进一步，本专利技术所述保藏号为CCTCCNo:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防治NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用是指，所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防止奶牛乳房炎药物中的应用。进一步，本专利技术所述保藏号为CCTCCNo:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌中的应用，所述环境包括养殖环境和医疗环境。进一步，本专利技术所述保藏号为CCTCCNo:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌中的应用，所述养殖环境包括料槽、地面、墙壁、垫料、饲料、饮水或空间环境。进一步，本专利技术所述保藏号为CCTCCNo:M2015760肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌中的应用是指，将浓度为108PFU/mL的肺炎克雷伯氏菌噬菌体液喷施于环境中，施用量为1mL/m2与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_he1具有较强的杀灭活性和较宽的裂解谱，既可以特异性裂解NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌，也可以杀灭不含NDM-1基因的其它多重耐药的肺炎克雷伯氏菌，应用于制备防治肺炎克雷伯氏菌感染的药物中可实现广谱杀菌的效果。(2)该噬菌体vB_KpnM_he1经小鼠试验，毒副作用小，安全性高；由于NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌噬菌体具有较好的亲水相，容易配制成喷洒液、药浴液或注射液，对环境的NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌的污染可进行有效杀灭。附图说明图1.噬菌体vB_KpnM_he1噬菌斑照片。图2.噬菌体vB_KpnM_本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_he1（

【技术特征摘要】
1.一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体vB_KpnM_he1（klebsiellapeneumoniaephagevB_KpnM_he1），所述噬菌体保藏号为CCTCCNo:M2015760，所述噬菌体为双链DNA噬菌体，其头部为正二十面体，有可伸缩性尾部，属于肌尾病毒科。2.如权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在裂解NDM-1阳性肺炎克雷伯氏菌株中的应用。3.如权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在制备防治肺炎克雷伯氏菌感染的药物中的应用。4.如权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体在杀灭环境中肺炎克雷伯氏菌中的应用。5.如权利要求3所述应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：何涛，王冉，葛展霞，孙利厂，庞茂达，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32