本发明专利技术公开了针对Bt毒蛋白Cry1B纳米抗体，同时还公开了编码该纳米抗体的基因序列。通过本发明专利技术所公开的Cry1B纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于Cry1B分子检测试剂的研发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学或生物制药
，尤其涉及一种针对Bt毒蛋白CrylB的 纳米抗体及其编码序列和应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis,Bt)为革兰氏阳性菌，是一类对害虫 毒力强、致死速度快且对害虫天敌无毒性的昆虫病原微生物。菌体在稳定生长期可形成伴 胞晶体蛋白质，又称杀虫晶体蛋白质（Insecticidalcrystalprotein,ICP)。杀虫晶体蛋 白质对靶标害虫具有较强的毒性。根据Bt毒蛋白基因同源性，将表达的Bt毒蛋白分为多 种类型，以Cry毒素命名。这些毒素原本仅对特定的害虫有活性而对哺乳动物与人类应当 没有任何作用，但有报道显示转Bt基因作物对根际土壤的菌根真菌的生长具有明显影响， 高剂量的Bt蛋白质对幼鼠的骨骼骨化有一定的延缓作用，如果长期大剂量使用，血液中白 细胞总数和血红蛋白质含量显著下降，表明Bt蛋白质具有较明显的免疫抑制毒性。近年 来，随着转Bt基因植物大规模商业化，由其引起的食品安全性和环境安全性引起人们广泛 的关注。越来越多的国家要求对转基因产品实行标签制度，对产品进行转基因成分检测以 确定是否含有、含量多少以及含什么种类的转基因。因此建立快速、准确的检测方法显得尤 为重要。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种CrylB纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳 米抗体用于检测CrylB分子的用途。 本专利技术采用以下技术方案： 本专利技术第一方面，提供了一种CrylB纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决 定区CDR，所述框架区FR包括下组的FRl?FR4的氨基酸序列：SEQIDNO: 1所示的FR1， SEQIDNO: 2所示的FR2,SEQIDNO: 3所示的FR3,SEQIDNO:4所示的FR4;所述互补决 定区CDR包括下组的CDRl?CDR3的氨基酸序列：SEQIDN0:5所示的CDR1，SEQIDN0:6 所示的CDR2,SEQIDNO:7 所示的CDR3。 优选地，所述的CrylB纳米抗体的VHH链，其氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。 本专利技术第二方面，提供了一种CrylB纳米抗体，其针对Bt毒蛋白CrylB的纳米抗 体，包括一条如SEQIDNO:8所示氨基酸序列的VHH链。 本专利技术第三方面，提供了一种DNA分子，其编码选自下组的蛋白质：权利要求1或 2所述的CrylB纳米抗体的VHH链，或权利要求3所述的CrylB纳米抗体。 优选地，所述的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。 本专利技术第四方面，提供了一种表达载体，其含SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。 本专利技术第五方面，提供了一种宿主细胞，其可以表达本专利技术所述的CrylB纳米抗 体。 本专利技术第六方面，提供了本专利技术所述的CrylB纳米抗体用于检测CrylB分子的用 途。 本专利技术的有益效果： 本专利技术利用CrylB蛋白免疫新疆双峰驼，经6次免疫后，收集该免疫骆驼外周血淋 巴细胞，建立了针对CrylB的噬菌体展示纳米抗体基因库。将CrylB抗原偶联在ELISA酶 标板上，利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了带有特异性针对 CrylB的纳米抗体基因的菌株，将此基因转入大肠杆菌中，建立了能在大肠杆菌中高效表达 的纳米抗体株。本专利技术获得的CrylB纳米抗体分子量小，仅为普通抗体的1/10,化学性质 稳定性好，产量高，特异性强，对其他Cry毒素无交叉反应，对CrylB具有良好的免疫检测效 果，为建立快速、准确检测CrylB毒蛋白质的免疫学检测方法奠定基础。【附图说明】 图1是CrylB纳米抗体纯化图，左道为蛋白标准分子，右道为经过镍柱树脂凝胶亲 和层析纯化后的CrylB纳米抗体。【具体实施方式】 本专利技术首先采用CrylB免疫一只新疆双峰驼，经过6次免疫之后提取该双峰驼外 周血淋巴细胞并构建了CrylB特异的单域重链抗体文库。将CrylB抗原偶联在酶标板上， 展示蛋白质的正确空间结构，使得CrylB的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用 噬菌体展示技术筛选CrylB免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库）， 而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，并且对CrylB具有高度特异性。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术： 实施例1 :针对于CrylB的纳米抗体文库的构建： (1)将ImgCrylB抗原（购自上海佑隆生物科技有限公司）与弗氏佐剂等体积 混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫6次，第一次用完全佐剂，后五次用不完全佐 剂，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；（2) 6次免疫结束后，提取IOOmL骆驼外周血淋 巴细胞并提取总RNA; (3)合成cDNA并利用二次PCR扩增VHH; (4)利用限制性内切酶PstI 及NotI酶切20ygpComb3 菌体展示载体（Biovector供应）及10ygVHH并连接两个片 段；（5)将连接产物转化至电转感受态细胞TGl中，构建CrylB纳米抗体文库并测定库容， 库容大小为2.OX109CFU/mL。（6)随机挑取24颗克隆，通过菌落PCR检测所建文库的插入 率检测结果插入率为100%。 利用二次PCR扩增VHH的具体条件如下： 第一次PCR体系包括模板cDNA,上游引物CALL001，下游引物CALL002 ; 第二次PCR体系包括模板第一次PCR割胶回收产物，上游引物BACK-1，下游引物 BACK-2。第一次PCR和第二次PCR程序均为：预变性94 °C、7min，变性94 °C、Imin，退火 55。〇、11]1；1；[11。 引物序列如下： CALL001如SEQIDNO:10所示：5'-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3'CALL002 如SEQIDNO:11 所示：5' -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'BACK-I如SEQIDNO:12 所示：5'-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGG-3'BACK-2 如SEQIDNO:13 所示：5'-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGG-3' 实施例2当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Cry1B纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR包括下组的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQ ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO:2所示的FR2，SEQ ID NO:3所示的FR3，SEQ ID NO:4所示的FR4；所述互补决定区CDR包括下组的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO:5所示的CDR1，SEQ ID NO:6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：万亚坤，王平艳，严俊荣，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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