本发明专利技术涉及针对恶性黑素瘤Ｔ细胞抗原表位多肽Ｍａｒｔ１的纳米抗体，本发明专利技术还公开了同时提供该纳米抗体的编码序列，表达或能够表达所述纳米抗体的宿主细胞，该纳米抗体能在大肠杆菌中高效表达，能应用于制备检测和治疗恶性黑素瘤的药物组合物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学或生物制药
，特别涉及一种针对恶性黑素瘤T 细胞抗原表位多肽Martl多肽的纳米抗体。
技术介绍
恶性黑素瘤发病率不高，但是是一种表皮或粘膜的黑素细胞的恶性肿瘤，恶 性程度高，且易发生血行及淋巴转移，预后不良。据上海肿瘤医院的资料，本 病占皮肤恶性肿瘤的1 0 %，占全部肺瘤的1 - 2 %，近年来有增加趋势。治疗 措施手术切除，放射治疗，化学治疗(用于有转移者)和免疫疗法(如用卡介 苗、白介素II、 a-干扰素等作为辅助治疗)或综合以上四种方法结合治疗 《http:〃www.biox.cn/content/20050910/37264.htm》。国外近年在临床试用恶性黑 素瘤T细胞抗原表位多肽(gp100, Martl)的疫苗，其效果也还不能最终肯定。 纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结 合纳米粒子科学的概念，进行的抗体工程革命，而研发的最新和最小的抗体分子， 最初由比利时的科学家(Hamers, R)在骆驼血液中发现。普通的抗体蛋白由两 条重链与两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻 链，这些"重链抗体"能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，而且不像单链 抗体那样互相私连聚集成块。以该"重链抗体"为基础的纳米抗体不仅分子量 只有普通抗体的1/10,而且化学性质也更加灵活，能与酶的活性部位和细胞膜中 镶嵌的标志等特殊的或不暴露的抗原表位结合在一起，因而应用纳米抗体技术研 发新颖肿瘤治疗和斥全测试剂具有广阔的前景。三
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种针对恶性黑素瘤T细胞抗原表位的纳米抗体，同4时提供该纳米抗体的编码序列以及该纳米抗体在制备检测和治疗恶性黑素瘤的 药物组合物中的应用。技术方案本专利技术的技术解决方案为即在本专利技术的第一方面，提供了一种恶性黑素瘤T细胞纳米抗体V朋链，它 的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列SEQ ID NO:ll所示的CDR1, SEQ ID NO:12所示的CDR2, SEQ ID NO:13 所示的CDR3;或SEQ ID NO:14所示的CDR1, SEQ ID NO:15所示的CDR2, SEQ ID NO:16 所示的CDR3;或SEQ ID NO: 17所示的CDR1 ， SEQ ID NO: 18所示的CDR2, SEQ ID NO: 19 所示的CDR3;或SEQ ID NO:20所示的CDR1, SEQ ID NO:21所示的CDR2, SEQ ID NO:22 所示的CDR3;或SEQ ID NO:23所示的CDR1, SEQ ID NO:24所示的CDR2, SEQ ID NO:25 所示的CDR3。较佳地，所述的恶性黑素瘤T细胞纳米抗体VHH链具有SEQ ID NO: 1 、 2 、 3、 4或5所示的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供了一种恶性黑素瘤T细胞纳米抗体，它针对恶 性黑素瘤T细胞抗原表位Marti多肽GAAGIGILIV,包括两条具有SEQ ID NO:l 、 2、 3、 4或5所示的氨基酸序列的VHH链。在本专利技术的第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质 本专利技术所述的恶性黑素瘤T细胞纳米抗体VHH链或恶性黑素瘤T细胞纳米抗体， 较佳地，所述DNA分子具有选自下组的DNA序列SEQIDNO:6、 7、 8、 9或 10。在本专利技术的第四方面，提供了一种表达载体，它含SEQIDNO:6、 7、 8、 9 或10所示的核苦酸序列，还包含与所述核苦酸序列操作性相连的表达调控序列。 在本专利技术的第五方面，提供了一种宿主细胞，其含本专利技术所述的表达载体。 在本专利技术的第六方面，提供了本所述恶性黑素瘤T细胞纳米抗体用于检测5恶性黑素瘤的用途。本专利技术的最后一方面，提供了一种4全测和治疗恶性黑素瘤的药物组合物，其 含有药学上有效量的本专利技术所述的恶性黑素瘤T细胞纳米抗体以及药学上可接 受的载体。有益效果本专利技术针对恶性黑素瘤特异性的T细胞抗原表位多肽如Martl多肽一 GAAGIGILIV生物素化后，与亲和素磁珠结合，展示多肽的正确空间结构，以 此形式的抗原筛选非免疫纳米抗体基因库(駱驼重链抗体噬菌体展示基因库)， 而获得了针对恶性黑素瘤特异性的纳米抗体基因，将此基因与表达载体重组，构 建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体;f朱。四附图说明图1是MT-弁1纳米抗体蛋白的质粒图； 图2是MT-#5纳米抗体蛋白的质粒图3是高压液相纯化MT-#1， MT-#2纳米抗体蛋白的SDS-聚丙烯凝胶电泳图， 从右至左各蛋白带分别为第1为蛋白分子量标准，从第2到10为MT-#1纳 米抗体高压液相纯化洗脱峰管28， 30, 32, 34， 36, 38, 40， 42, 44;第11到 15为MT-#5纳米抗体高压液相纯化洗脱峰管32, 34, 36， 38, 39,纳米抗体+白喉 内毒素B亚单位分子量约为29KD。五具体实施例方式本专利技术应用针对恶性黑素瘤特异性的T细胞抗原表位多肽Martl多肽一 GAAGIGILIV生物素化后，与亲和素磁珠结合，展示多肽的正确空间结构，以 此形式的抗原筛选非免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)， 而获得了针对恶性黑素瘤特异性的纳米抗体基因，将此基因与表达载体重组，构 建了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体林。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。6实施例1:针对恶性黑素瘤特异性的T细胞抗原表位多肽Martl多肽一GAAGIGILIV 的纳米抗体筛选过程(1)用生物素化的Martl多肽一GAAGIGILIV 20孩i克分别与亲和素^兹珠 (Product by Invitrogen company) 100微克在室温下结合2小时。同时用100微 升噬菌体(5x1011 tfu非免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)+100微克亲和 素磁珠+500微升的2%脱脂牛奶O.OIM磷酸盐緩冲液(PBS)， pH7.0,在室温下 作用2小时。(2)去掉(1 )中的生物素-亲和素^兹珠结合物的上清，加入经亲和 素》兹珠吸附过后的的噬菌体，在室温下结合2小时。(3)用0.05%吐温20 (T) PBS (PBST)和PBS各洗5次，以洗掉不结合的噬菌体。(4 )用TEA (triethylamine (7.18M))将与多肽特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠 杆菌TGl,产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。相同筛选过程重复3 4轮。实施例2:用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选多肽特异性单个阳性克隆 (1 )从上述经3~4轮筛选后含有噬菌体的细菌培养亚中，挑选单个菌落并 接种于96孔细菌培养板中，培养过夜，(2)将其含有噬菌体的上清液转移到经 亲和素预先包被并与生物素化的Martl多肽一GAAGIGILIV结合的ELISA板中， 在室温获37度放置1~2小时，(3)用PBST洗去未结合的噬菌体，(4)加入辣 根过氧化物酶标记的抗噬菌体抗体，作用1小时，(5)TMB显色，于ELISA仪 上，在450nm波长，读取吸收值(OD)。 (5)当样品孔OD值大于对照孔OD 值3倍以上，判为阳性克隆孔。(6) PCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种恶性黑素瘤Ｔ细胞纳米抗体ＶＨＨ链，其特征在于它的互补决定区ＣＤＲ具有选自下组的ＣＤＲ的氨基酸序列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１所示的ＣＤＲ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２所示的ＣＤＲ２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３所示的ＣＤＲ３；或 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４所示的ＣＤＲ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５所示的ＣＤＲ２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６所示的ＣＤＲ３；或 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７所示的ＣＤＲ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８所示的ＣＤＲ２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９所示的 ＣＤＲ３；或 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０所示的ＣＤＲ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１所示的ＣＤＲ２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２所示的ＣＤＲ３；或 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３所示的ＣＤＲ１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４所示的ＣＤＲ２，ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：２５所示的ＣＤＲ３。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王大升，
申请(专利权)人：无锡胜博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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