本发明专利技术属于生物医药领域，涉及亚细胞定位的融合蛋白及其应用。本系统主要基于分泌型荧光素酶，可从细胞器水平报告炎症小体的活性。本系统中所包括的7种质粒主要通过将细胞器定位基因、白介素1β前体编码基因(pro-IL-1β)和分泌型荧光素酶(DN-Gluc)顺次克隆至表达载体pcDNA3.1的多克隆位点区域而得到。将本系统所包含的各质粒分别转染至靶细胞中，可通过检测细胞外上清液中的荧光素酶活性，对炎症小体的活性进行定量分析，具有高效、快捷和简便等优势，应用于炎症小体相关的药物筛选、分子机制、动物活体研究及相关产品的开发。
【技术实现步骤摘要】
亚细胞定位的炎症小体活性报告系统及其应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种融合蛋白及其编码序列和应用。
技术介绍
炎症小体(Inflammasomes)介导机体的抗感染免疫，是先天性免疫的重要组成部分，主要通过Caspase-1加工白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-18前体、产生相应的成熟细胞因子调控炎症反应和细胞死亡(Pyroptosis)。已证实炎症小体参与各种疾病和癌症的发生。目前对炎症小体活性的检测主要依赖于ELISA和WesternBlot技术，分别检测成熟型IL-1β和Caspase-1的剪切情况，操作比较繁琐。又由于相应蛋白分子量较小(成熟型IL-1β为17Kda，而Caspase-1的P20亚基为20Kda)，且具有较强的细胞外分泌能力，故往往难以得到稳定的结果。各细胞器与炎症小体的联系已有报道，但炎症小体的亚细胞定位与活化的相互关系尚无报道或研究。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于提供一种可以定位于细胞器并且可以评价细胞器与炎症小体活性关系的融合蛋白。本专利技术目的之二在于提供上述融合蛋白的编码基因。本专利技术目的之三在于提供特定的融合蛋白/基因在制备或构建特定药物激发的炎症小体反应的检测或报告系统中的应用。本专利技术构建各种细胞器定位的质粒，通过将IL-1β(pro-IL-1β)与分泌型Gaussia荧光素酶(DN-Gluc)和相应细胞器定位蛋白融合，特异性检测炎症小体激活的Caspase-1对细胞器定位IL-1β前体的加工，通过分析分泌到细胞外的荧光素酶的活性检测细胞器定位的炎症小体活性状态。本专利技术提供了分别于细胞质、线粒体、内质网、早期内体、晚期内体、溶酶体、高尔基体和细胞骨架定位的融合蛋白，分别命名为pro-IL-1β-DN-Gluc、Mito-pro-IL-1β-DN-Gluc、ER-pro-IL-1β-DN-Gluc、EE-pro-IL-1β-DN-Gluc、LE-pro-IL-1β-DN-Gluc、LYS-pro-IL-1β-DN-Gluc、GA-pro-IL-1β-DN-Gluc、Actin-pro-IL-1β-DN-Gluc。作为一种实施方式，上述融合蛋白的编码基因(如图1所示)分别为：pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.1)Mito-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.2)ER-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.3)EE-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.4)LE-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.5)LYS-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.6)GA-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.7)Actin-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.8)本专利技术同时提供了融合蛋白的氨基酸序列，分别为：pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.9)Mito-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.10)ER-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.11)EE-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.12)LE-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.13)LYS-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.14)GA-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.15)Actin-pro-IL-1β-DN-Gluc(SEQIDNo.16)本专利技术首次提供了一套结构为细胞器定位蛋白-白介素1β前体-分泌型荧光素酶的融合蛋白，将如SEQIDNo.2中的TOM20、SEQIDNo.3中的EMC3、SEQIDNo.4中的VAMP8、SEQIDNo.5中的RAB5、SEQIDNo.6中的LAMP2、SEQIDNo.7中的APOE、SEQIDNo.8中的ACTIN分别和SEQIDNo.2—8中的pro-IL-1β及DN-Gluc顺次克隆至pcDNA3.1表达载体的多克隆位点中，得到Mito-pro-IL-1β-DN-Gluc、ER-pro-IL-1β-DN-Gluc、EE-pro-IL-1β-DN-Gluc、LE-pro-IL-1β-DN-Gluc、LYS-pro-IL-1β-DN-Gluc、GA-pro-IL-1β-DN-Gluc和Actin-pro-IL-1β-DN-Gluc。pro-IL-1β(白介素-1β前体)是Caspase-1的切割对象，当炎症小体激活Caspase-1时，Caspase-1可切割该融合蛋白。本专利技术首次将细胞器定位蛋白(线粒体定位蛋白TOM20、内质网定位蛋白EMC3、早期内体定位蛋白VAMP8、晚期内体定位蛋白RAB5、溶酶体定位蛋白LAMP2、高尔基体定位蛋白APOE和细胞骨架定位蛋白Actin)与全长的IL-1β(pro-IL-1β)、分泌型Gaussia荧光素酶(DN-Gluc)融合。炎症小体未激活Caspase-1时，蛋白游离于胞浆中或定位于各细胞器上；而炎症小体活化后Caspase-1可切割该融合蛋白，产生的IL-1β-DN-Gluc可分泌到细胞外，从而可通过检测细胞外的荧光素酶活性可对炎症小体(即Caspase-1)的活性进行定量分析。本专利技术构建了上述分别定位于各细胞器的质粒系统，将本系统所包括的各质粒分别转染至靶细胞中，可通过检测细胞外上清液中的荧光素酶活性，对炎症小体的活性进行定量分析，具有高效、快捷和简便等优势，应用于炎症小体相关的药物筛选、分子机制和动物活体研究。因而，上述7种与细胞器相关的基因/质粒/融合蛋白，可以被应用与在炎症小体相关的药物筛选、分子机制和动物活体研究领域的应用。通过上述的融合蛋白或其编码基因，本专利技术得以研究各种细胞器在特定的炎症小体相关反应中所起的作用，研究发现细胞器与炎症小体的活化存在密切联系。本专利技术进一步地研究出用于检测或报告炎症小体活性的具有高特异性和灵敏度的检测/报告蛋白、基因、质粒等。本专利技术进一步提供了特定融合蛋白/基因的特定应用。首先，本专利技术提供了ER-pro-IL-1β-DN-Gluc在制备TPA相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。专利技术人通过TPA刺激和转染Caspase-1的方法诱导炎症小体激活，结果表明TPA刺激和转染Caspase-1均可引起融合蛋白切割的增加(图3A和3B)，而内质网更多地参与TPA对炎症小体的激活(图3A和3C)。将ER-pro-IL-1β-DN-Gluc蛋白或基因作为对TPA相关炎症小体活性的检测试剂或报告系统，将具有更好的灵敏度和适用性。专利技术还提供了Mito-pro-IL-1β-DN-Gluc在制备Nigericin或MDP相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。为了进一步探索不同激活剂对炎症小体激活过程中是否存在亚细胞定位现象，专利技术用多种炎症小体激活剂(Nigericin、MDP、HSV)刺激人肿瘤细胞。结果表明Nigericin和MDP对线粒体定位报告系统的激活程度明显更高，而HSV对线粒体定位和内质网定位的报告系统的激活程度相一致(图4)。将Mito-pro-IL-1β-DN-Gluc蛋白或基因作为Nigericin和MD本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组基因，其特征在于核苷酸序列选自SEQ ID No.2～SEQ ID No.8。
【技术特征摘要】
1.一种核苷酸序列选自SEQIDNo.2的重组基因，其特征在于所述的基因应用于制备检测或报告炎症小体活性的试剂。2.一种氨基酸序列选自SEQIDNo.10的融合蛋白，其特征在于所述的蛋白应用于制备检测或报告炎症小体活性的试剂。3.线粒体定位蛋白-白介素-1β前体-分泌型Gaussia荧光素酶融合蛋白的编码基因，在制备Nigericin或MDP相关的炎症小体活性检测试...
【专利技术属性】
技术研发人员：况二胜，李宇清，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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