一种在聚二甲基硅氧烷表面固定蛋白质的方法技术

本发明专利技术提供一种在聚二甲基硅氧烷表面固定蛋白质的方法，该方法首先在已固化的聚二甲基硅氧烷表面制备一层生物素化的聚二甲基硅氧烷薄膜；利用生物素-抗生物素蛋白、水溶性碳二亚胺化学以及3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒技术将蛋白质固定在聚二甲基硅氧烷表面；β-D-十二烷基-N-麦芽糖和牛血清白蛋白被分别用于封锁蛋白质在聚二甲基硅氧烷表面的非特异性吸附和在3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒表面处于激活状态的残余羧基基团。本发明专利技术的方法中，基于一个3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒表面含有多个羧基基团，可结合多个待固定蛋白质分子，将更多待固定蛋白质固定在聚二甲基硅氧烷表面，能有效提高后续ELISA检验的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于表面化学修饰
，具体涉及。
技术介绍
聚二甲基硅氧烷(PDMS)，俗称硅橡胶，是一种生物兼容性非常好的聚合物材料，是目前应用最广泛的微流控芯片加工材料之一。PDMS微流控芯片具有如下优点(1)制作成本低廉，制作过程方便快速，可批量生产；( 单体可低温聚合，对设备无特殊要求；(3)表面能低，容易与PDMS及其它材料如玻璃、其他高分子材料进行暂时性或永久性封合，而且在使用过程中，如果微管道堵塞，暂时封合的芯片可以拆开清洗后再封合使用，大大降低了使用成本；(4)生物兼容性好，无毒性；( 表面可进行多种化学处理；(6)低导电性。以 PDMS微流控芯片为平台进行免疫分析应用研究是简化和改善现有免疫检测方法性能的一个重要途径。通常微流控免疫分析法要求在微流控材料的表面固定蛋白质，现有的在相对惰性的PDMS表面固定蛋白质的方法包括(1)利用PDMS表面的本质的非特异性吸附现象， 进行固定蛋白质，(缺点是特异性差)；(2)利用等离子体处理PDMS表面，使其表面所产生的羟基进一步固定蛋白质(缺点是表面羟基寿命约为30秒，稳定性差，且需要实验者进行快速操作)；C3)利用紫外光激活PDMS表面或利用化学蒸镀(chemical vapor deposition) 方法，固定蛋白质(缺点是操作复杂)；(4)通过加生物素衍生化试剂进入未固化的PDMS前聚体中，直接利用特异性的生物素-抗生物素化学方法。相比之下，第四种方法具有特异性好、稳定、简单的优点，但缺点是只能直接固定抗生物素类的蛋白质，所能固定的蛋白质种类受到限制，并且掺杂固定在PDMS中的一个衍生化生物素分子最多只能连接一个抗生物素蛋白，导致固定的蛋白质量较少。因此，现有的在PDMS表面固定蛋白质的方法仍有待进一步的改进。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在PDMS表面固定蛋白质的方法，以克服现有的PDMS 表面固定蛋白质的方法或特异性差或不稳定或操作复杂或固定的蛋白质种类和数量有限的缺陷。该方法特异性高、稳定性好、操作简单、可固定各种蛋白质且固定蛋白质的数量多， 为后续的微流控芯片免疫分析检验奠定了基础。本专利技术提供一种在PDMS表面固定蛋白质的方法，首先将磷脂生物素加入到未固化的PDMS前聚体中，并涂布在一已固化的PDMS支撑层的表面，固化后在PDMS支撑层的表面形成一层生物素化的PDMS薄膜，接着依次用包含有β -D-十二烷基-N-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液(DPBS)、包含有抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液、包含有1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(MB)的3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒 (MPA-AuNPs)溶液浸泡所述PDMS薄膜表面，然后，用待固定蛋白质溶液浸泡所述PDMS膜表面，将待固定蛋白质固定在所述PDMS薄膜表面，最后用包含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面，即可完成在PDMS表面固定蛋白质。进一步地，生物素化的PDMS薄膜的制备为在PDMS前聚体/正己烷溶液中加入 5mg/mL磷脂生物素的氯仿溶液，PDMS前聚体与正己烷的质量比为1 2，PDMS前聚体/正己烷溶液与磷脂生物素的质量比为Ig 0. Olmg-Ig 0.05mg，然后涂布在所述已固化的 PDMS支撑层表面，在70-80°C下固化20-40分钟，形成一层生物素化的PDMS薄膜。进一步地，β-d-十二烷基-n-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液中，β-d-十二烷基-n-麦芽糖的百分含量为0. 1-0. 2衬％，所述磷酸盐缓冲溶液的？!1为7.4、浓度为 10mmol/Lo进一步地，用β -D-十二烷基-N-麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的浸泡时间为5-20分钟。进一步地，用含抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的浸泡时间为20-60分钟，所述含抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，抗生素蛋白的浓度为 100-300 μ g/mL0进一步地，所述包含有1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的mpa-aunps溶液的制备为将1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺加入到mpa-aunps溶液中，孕育ih进一步地，用包含有1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的MPA-AuNPs溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的浸泡时间为1_3小时。进一步地，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺在MPA-auni3s溶液中的最终浓度为0. lmol/L, N-羟基丁二酰亚胺在MPA-AuNPs溶液中的最终浓度为0. 4mol/L。进一步地，待固定蛋白质溶液为含有待固定蛋白质的磷酸盐缓冲溶液，其浸泡所述PDMS薄膜表面的温度为2-6°C，浸泡时间为6-Mh。进一步地，在用包含有1-乙基-3- (3- 二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的MPA-AuNPs溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的操作、将待固定蛋白质固定在所述PDMS 薄膜表面的操作、以及用含有1 % BSA的磷酸盐缓冲溶液浸泡所述PDMS薄膜表面的操作后， 均采用lOmmol/L pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液冲洗PDMS薄膜表面。进一步地，所述包含有抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β-d-十二烷基-n-麦芽糖，所述包含有1 % bsa的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β -d-十二烷基-n-麦芽糖，所述包含有待固定蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中还包括有β -d-十二烷基-n-麦芽糖。本专利技术的方法首先将磷脂生物素加入到未固化的PDMS前聚体中，并涂布在已固化的PDMS支撑层的表面，固化后形成一层生物素化的PDMS薄膜；利用生物素-抗生物素蛋白、水溶性碳二亚胺化学以及3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒技术将蛋白质固定在PDMS表面；β -D-十二烷基-N-麦芽糖和牛血清白蛋白被分别用于封锁蛋白质在PDMS表面的非特异性吸附和在MPA-AuNPs表面处于激活状态的残余羧基基团。本专利技术所述的方法中，利用金纳米颗粒比表面积大、以及MPA-AuNPs表面含有多个羧基基团的特点，可将各种类蛋白质更多量地固定在PDMS表面，克服了现有的生物素衍生化PDMS方法仅能在PDMS表面固定抗生物素类蛋白质且固定的抗生物素类蛋白质量少的缺陷。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是(1)本专利技术是在生物素化PDMS表面的基础上，利用生物素-抗生物素蛋白、水溶性碳二亚胺化学以及3-巯基丙酸稳定的金纳米颗粒(MPA-AuNPs)技术将蛋白质特异性固定在PDMS表面，特异性好，且可以固定各种类蛋白质；(2)本专利技术利用金纳米颗粒比表面积大的特点，可增加固定的蛋白质量，有效提高后续微流控免疫分析检验的灵敏度；(3)本专利技术利用生物素与抗生物素蛋白之间的强亲和作用以及抗生物素蛋白与 MPA-AuNPs、待固定蛋白质与MPA-AuNPs之间的共价键结合，将待固定蛋白牢固结合到PDMS 表面，具有良好的稳定性；(4)本专利技术的方法条件温和、操作方便。附图说明图1为本专利技术的PDMS表面抗体蛋白固定示意图。图2A-B为PDMS薄膜表面的ATR4R(衰减全反射红外)光谱图。曲线1、2、3、4、5 分别代表本性的PDMS薄膜、用DP本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种在聚二甲基硅氧烷（ＰＤＭＳ）表面固定蛋白质的方法，其特征在于，首先将磷脂生物素加入到未固化的ＰＤＭＳ前聚体中，并涂布在一已固化的ＰＤＭＳ支撑层表面，固化后在ＰＤＭＳ支撑层表面形成一层生物素化的ＰＤＭＳ薄膜，接着依次用β－Ｄ－十二烷基－Ｎ－麦芽糖的磷酸盐缓冲溶液、包含有抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液、包含有１－乙基－３－（３－二甲氨基丙基）碳二亚胺和Ｎ－羟基丁二酰亚胺的３－巯基丙酸稳定的金纳米颗粒（ＭＰＡ－ＡｕＮＰｓ）溶液浸泡所述ＰＤＭＳ薄膜表面，然后，用待固定蛋白质溶液浸泡所述ＰＤＭＳ膜表面，将待固定蛋白质固定在所述ＰＤＭＳ薄膜表面，最后用包含有１％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的磷酸盐缓冲溶液浸泡固定所述ＰＤＭＳ膜表面。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴会灵，陈肇娜，纪季，范国荣，刘宝红，杨芃原，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31