基于巨细胞病毒的免疫原性制剂制造技术

本发明专利技术涉及使用重组的复制缺陷型巨细胞病毒(CMV)在受试者中产生长期的、重复刺激的基于T细胞的免疫应答的方法，例如，对抗由巨细胞病毒表达的异源抗原的免疫应答。进一步涉及使用重组的复制缺陷型CMV作为抗癌的免疫原性制剂的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用重组的复制缺陷型巨细胞病毒(CMV)在受试者中产生长期的、永久激活的基于T细胞的免疫应答的方法，例如抗由巨细胞病毒表达的异源抗原的免疫应答。本专利技术进一步涉及使用重组的复制缺陷型CMV作为抗癌的免疫原制剂的方法。政府支持的声明本专利技术是利用NIH授予的基金号ROlAI 47206和21CA12718和国防部授予的基金号BC084377的政府资助完成的。政府对本专利技术具有一定的权利。
技术介绍
·虽然肿瘤和病毒免疫学之间有明显的相似性(parallel)，但是在其领域它们的差异更加显著。病毒通常是具有强力的免疫原性的、激活先天免疫“危险”信号(例如，Toll样受体信号转导)和呈现丰富的外来抗原。肿瘤通常最多包含突变的或过表达的自身蛋白作为抗原，并可能引起免疫耐受而不是免疫激活。因此，肿瘤疫苗的目的之一是诱使免疫系统来治疗肿瘤，就好像它是病毒而不是无害的自身组织。鉴于发现表观肿瘤根除后肿瘤可以作为微转移或癌症干细胞持续存在，特别希望的是产生稳定的和长效的免疫应答。这些细胞自己可能很少分裂，因此在放疗和化疗中存活。然而，他们的后代是具有致命的肿瘤产生能力的典型的癌细胞。由于癌症干细胞可以保持休眠数月或数年，肿瘤疫苗接种的另一个目的是在消除最初的肿瘤负荷之后长时间内提供警醒的免疫监视。在理想的情况下，这种免疫监视涉及⑶8+T细胞，该细胞可以巡视组织以检测微转移，而不是等待肿瘤被传递到引流淋巴结。肿瘤表位的弱免疫原性及免疫系统通常由免疫耐受而非通过启动强力的效应子应答对他们作出响应的事实阻碍了成功的肿瘤免疫治疗。理想的免疫治疗肿瘤疫苗会引发(a)稳定的、(b)有效的、(C)抵抗免疫耐受的发生、(d)长效的及(e)在最初的肿瘤控制之后对于抗复发和转移的“免疫监视”任务有效的免疫应答。由巨细胞病毒(CMV)感染引发的稳定的终身免疫应答和CMV克服自体耐受性的能力表明CMV可以是理想的肿瘤免疫治疗的疫苗载体。CMV是疱疹病毒家族β亚类的成员。它是建立终身的潜伏性或持续性感染的大的(包含230kb基因组)、双链DNA病毒。在发达国家如美国，约70%的人口感染了 CMV。与Y疱疹病毒例如Epstein-Barr病毒和卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒相反，CMV为非转化的和非致癌的。减毒的CMV活疫苗(基于缺乏一部分CMV基因组的人类CMVTowne病毒株)已经于II期和III期的安全性和有效性临床试验中通过皮下注射施用于超过800名受试者(Arvin等.,Clin. Infect. Dis. 39 =233-239, 2004) 虽然这种疫苗被认为是完全安全的，但它不是完全有效的。最近，为试图增加其疗效，替换了 Towne疫苗株中缺失的一些基因。该疫苗已经在II期的安全性研究中进行了测试，并被认为是安全的(Arvin等,Clin. Infect.Dis. 39 :233-239,2004)。已在几份报告中证明了活的、重组的CMV产生抗重组抗原的免疫应答的能力(Hansen 等，Nat. Med. 15 :293-299, 2009 ；Karrer 等，J. Virol. 78 :2255-2264, 2004)。此夕卜，最近已证明，经工程化以表达自身蛋白的重组的有复制能力的CMV会产生抗表达该自身蛋白的细胞的长效的、基于CD8+T细胞的免疫力(Lloyd等，Biol. R印rod. 68 =2024-2032,2003)。由于大多数的肿瘤抗原是过表达的自身蛋白，该结果为使用CMV载体诱导对肿瘤的免疫应答的概念提供了支持。最值得注意的是，Hanson等使用表达SIV抗原的重组猕猴CMV来免疫猕猴抗SIV (Hansen等，Nat. Med. 15 =293-299,2009)。该免疫诱导大量对外周组织中的SIV特异性的激活的“效应子记忆”CD8+T细胞，这在为时多年的整个研究中是持续的。明显的是，免疫的猴子受到SIV激发的实质保护，这是由于激活的效应子记忆T细胞的存在。该研究还表明，对CMV的预先存在的免疫力并没有阻止重组CMV诱导新的免疫应答的能力。尽管减毒的CMV活疫苗是表观安全的，但对基于CMV的活疫苗的策略仍然保持明显关注。虽然在健康个体中CMV感染通常是完全无症状的，但在免疫抑制个体(如艾滋病 患者、器官移植接受者或在子宫内感染的婴儿)中可能会产生问题。此外，基于CMV的肿瘤疫苗的潜在接受者可能是或者可能变成免疫缺陷的，从而显著限制了活的CMV肿瘤疫苗的使用。因此，存在着在免疫受损个体中完全安全的CMV疫苗载体的持续需要。专利技术概述本文公开的是令人惊讶地发现，完全不能在细胞间传播的复制缺陷型CMV能够在受试者体内产生长期的免疫应答。因此，本文所描述的是在受试者体内产生长期的重复刺激的抗异源抗原的免疫应答的方法。该方法包括通过腹膜内或静脉内施用向受试者施用(例如，以单一剂量)包含编码异源抗原的异源核酸的重组的复制缺陷型巨细胞病毒，由此在受试者体内建立病毒潜伏，该潜伏导致对抗该抗原的重复刺激的免疫应答。在特定的实施例中，刺激的免疫应答是抗细菌、真菌、病毒或肿瘤源的多肽的。还描述了被诊断患有癌症的受试者的治疗方法，包括对受试者施用一种化疗或免疫抗癌试剂或者化疗和免疫抗癌试剂的组合；并且通过腹膜内或静脉内施用向相同的受试者施用包含编码源自癌症的异源抗原的异源核酸的重组的复制缺陷型巨细胞病毒，由此在受试者体内建立病毒潜伏，该潜伏导致抗癌症的刺激的免疫力。通过参照附图的下面的详细的描述，本专利技术的上述的和其它的目标、特征和优势将变得更加明白。附图简要说明图I是CMV感染后随着时间的推移，比较病毒滴度和CMV-反应性T细胞的曲线图。图2显示了由MCMV-IE2_ova疫苗和B16-D5_ova肿瘤激发诱发的免疫应答。A)在用MCMV-ova或仅载体接种6个月后的外周血中，卵清蛋白肽SIINFEKL的细胞内细胞因子染色(ICS)分析测量值直接在体外测定。上图用SIINFEKL刺激。下图无肽。B)如在A中测定的外周血中SIINFEKL特异性反应的ICS测量值，作为接种6个月后但在肿瘤激发之前和在肿瘤激发之后17天，6只接种的小鼠中总CD8+T细胞的百分数。C)在接种小鼠和对照小鼠中肿瘤发展的过程，显示为在接种后的指定天数保持无肿瘤的小鼠的百分比。大多数动物在产生可触知的肿瘤的七天内死亡。一只接种的小鼠(图2B中的#4)保持无瘤。图3为显示MCMV-感染的B6小鼠中T细胞应答的一对图。在感染的急性期(之后7天)和慢性期(之后7天)中C57BL/6小鼠的感染诱导了可重复的免疫优势层级。图4是一系列显示用具有复制能力的MCMV感染的小鼠中⑶8+T细胞记忆扩张(memory inflation)的图。在第O周用MCMV感染C57BL/6小鼠(n_5)。在感染后指定周，由尾部放血获得外周血并通过四聚体染色测定对于三个MCMV表位(ml39、m38和IE3)的反应。以血液中总CD8+淋巴细胞的百分比对表位特异性的反应作图。符号表示动物个体；线表示平均值。未感染对照的背景四聚体染色<0.2%。图5是一系列显示用复制缺陷型MCMV感染的小鼠中⑶8+T细胞的记忆放大的图。A)用野生型MCMV感染的小鼠用实心圆表示和用复制缺陷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.在受试者体内产生抗异源抗原的长期的、重复刺激的免疫应答的方法，包括 通过腹膜内或静脉内施用给受试者施用包含编码所述抗原的异源核酸的重组的复制缺陷型巨细胞病毒，由此在受试者体内建立病毒潜伏，从而产生抗该抗原的重复刺激的免疫应答。2.权利要求I的方法，其中所述重复刺激的免疫应答包括CD8+T细胞的免疫应答。3.权利要求I或权利要求2的方法，其中所述异源抗原包括细菌、真菌、病毒或肿瘤源的多肽。4.权利要求3的方法，其中所述肿瘤源的多肽是癌抗原。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述重组的复制缺陷型巨细胞病毒包含灭活的gB、gD、gH或gL糖蛋白基因。6.权利要求5的方法，其中所述灭活的基因编码gL糖蛋白。7.权利要求6的方法，其中所述编码gL糖蛋白的基因是通过敲除突变灭活的。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述编码抗原的核酸可操作地与组成型启动子连接。9.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述编码抗原的核酸可操作地与诱导型启动子连接。10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述重组的复制缺陷型巨细胞病毒是鼠巨细胞病毒。11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述重组的复制缺陷型巨细...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·B·希尔，C·M·斯奈德，
申请(专利权)人：俄勒冈健康科学大学，
类型：
国别省市：