用于病毒生长的固定化细胞系制造技术

自发永生化的细胞系，来自原代鸡胚成纤维细胞，具有ＵＭＮＳＡＨ－ＤＦ１细胞系的特征，保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为＃ＣＲＬ－１２２０３。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞生物学和病毒学领域。更具体而言，本专利技术涉及用于病毒增殖的固定化细胞系的应用。
技术介绍
1931年，Alices Miles Woodruff和Goodpasture介绍了培养病毒的一种新方法。他们报导，禽痘病毒可以在发育鸡胚的尿囊绒膜上生长。接种病毒后，在膜上出现含病毒的病斑。与用作早期病毒研究基质的动物相比，禽蛋相对较便宜，易于获得。禽蛋具有多种细胞，膜易于为不同病毒感染，并可保持可控制的稳定状态。由于可以方便地提供多种病毒易感的多种细胞类型，鸡胚对病毒学的发展作出了重要贡献。尽管禽蛋支持多种病毒株的复制，但感染禽蛋和维持病毒生长的方法既费时又费力。例如，尿囊绒膜接种时，首先在蛋壳和壳膜上打一个孔。在气囊处的蛋壳上打孔，让空气进入壳膜和尿囊绒膜之间，形成一个人工气囊，将样品置于此处。样品接触绒膜上皮，病毒在膜上生长成病斑。正如预料的那样，随着细胞培养技术的出现，使用禽蛋进行病毒复制已经减少。多种细胞均可以在体外生长。与禽蛋相比，细胞培养物容易维持，并能保持在高度可控制的环境下。然而，仍有一些病毒株在含胚卵细胞上生长似乎较在培养细胞上好。此外，很多培养细胞系携带内源的感染因子，包括原虫，低水平细菌污染，内源病毒等。某些支持病毒复制最有效的细胞类型在病毒原种生产方面存在问题，即细胞含有内源病毒。内源病毒或以低水平复制或在细胞感染另一种病毒株后激活。例如，已知啮齿动物细胞携带内源病毒，培养中啮齿动物细胞的电镜照片经常可见细胞内存在着可识别的病毒粒子。污染的细胞系不能用作活的或灭活商用疫苗的基质。对于某些病毒，选用的病毒复制方法是含胚鸡卵。例如，人流感病毒、狂犬病毒、犬温热病毒、禽疱疹病毒1型、呼肠病毒和禽痘病毒优先在含胚卵(因为卵支持高滴度病毒原种的生长)或来自含胚卵的原代细胞上生长。其它情况下，病毒在卵中生长，因为需要可靠的无病毒细胞基质。原代细胞培养物是由完整组织新分离的细胞培养物。这些细胞通常为无病毒材料的良好来源，非常适合作为病毒复制的宿主细胞。原代细胞用来复制病毒并非总是有效，原代动物细胞在培养物中的寿命有限，最终会衰老。衰老细胞停止分裂，最终死亡。培养细胞的长期分裂能力取决于几个参数，包括细胞来源的种类，培养时组织的年龄。衰老的细胞无法长期培养，因而不能作为商用病毒原种生长的可增殖宿主。某些原代细胞不会衰老，而获得了无限增殖的能力。啮齿动物细胞似乎非常容易发生自发的永生化(Curatolo等，In Vitro 20597-601，1984)，但普通人和鸟细胞即使能够自发永生化，也非常少见(Harvey等，Genes andDevelopment 52375-2385，1991；Pereira-Smith，J.Cell Physiol 144546-9，1990；Smith等，Science 27363-67，1996)。为何特定的细胞群体会永生化有多种原因。用已知诱导基因突变的试剂处理细胞可以诱导细胞永生化。有些人推测相对于衰老的生长停止主导着永生化，灭活生长抑制基因的事件可以导致永生化(Perira-Smith等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)856042-6046，1988)。获得永生化无病毒细胞可以无需或减少使用原代动物组织培养物。原代培养物通常是不定的细胞群体，并且经常被污染。这些培养物经常不能满足商用疫苗制品的强制性要求。原代细胞培养物可以被Cirodnaviredeae(如Chickenenima病毒)或Egg Drop综合征病毒污染。例如，Marek病疫苗(一种活病毒疫苗)可以在鸭蛋上作为病毒原种生长，用于家禽接种。1976年，接种了该疫苗的鸡群显示出Egg Drop综合征的迹象，这是由鸭腺病毒引起的，据信该病毒污染了疫苗原种，并已改变可在鸡中生长。在疫苗工业中，对产品安全、稳定性和效力的强制性要求驱使各公司采用细胞系作为现在应用卵基和原代细胞的疫苗基质实践的最佳替代途径。在美国和欧洲，由于对疫苗基质的强制性环保要求日益严格，在人用和兽用疫苗制品的生产过程中均需考虑安全和稳定性。考虑到美国政府对试验、研究和驯养脊椎动物利用和保护的规定和动物保护法(7 U.S.C.ξ2131)规定，在所有情况下，应当考虑用体外生物系统等方法代替活体动物模型系统，鉴定适合病毒生长的细胞系代替含胚卵也是有利的。需求的细胞是无病毒并支持外源病毒生长从而产生动物疫苗制品的细胞。专利技术概述本专利技术涉及自发永生化的鸡成纤维细胞系的鉴定和获得该细胞系的方法。具体而言，本专利技术涉及来自原代鸡胚成纤维细胞的自发永生化细胞系，其具有自发永生化细胞系UMNSAH-DF1的特征，根据布达佩斯条约的规定保藏于ATCC。此外，本专利技术涉及这些细胞的培养物和这些永生化细胞系的永生化亚克隆，它们支持病毒复制。一方面，本专利技术的永生化细胞含有病毒，本专利技术的另一种永生化细胞含有至少一种能够指导重组蛋白在细胞中表达的载体。在一个实施方案中，本专利技术的细胞表达重组蛋白，另一方面，本专利技术细胞中包含的载体编码重组病毒的至少一部分。在另一个实施方案中，该载体为逆转录病毒载体。另一方面，本专利技术公开了一种由鸡胚成纤维细胞产生永生化细胞系的方法，包括以下步骤培养原代鸡胚成纤维细胞；将培养物中的成纤维细胞传代直至它们开始细胞衰老；在细胞衰老时浓缩细胞以维持大约30％到60％的培养物汇合；鉴别非衰老细胞转化灶；培养非衰老细胞30代以上。再一方面，本专利技术公开了一种在细胞中培养病毒的方法，包括以下步骤培养来自原代鸡胚成纤维细胞的自发永生化细胞系；用病毒感染细胞；使病毒在细胞中复制；收集在细胞中复制的病毒。优选实施方案详述目前还没有基本无病毒、无病毒蛋白或非化学转化的禽细胞系供应。原代细胞系难以持续产生用于病毒原种生产，必需分别证实为无污染的基质才能用于病毒生长。本专利技术公开了鸡胚成纤维(CEF)细胞包括来自EastLansing Line(ELL-0)鸡胚的细胞的永生化。本文中，永生化指能够连续培养30代以上的非啮齿动物细胞，培养物中倍增时间保持为约1-2天，已连续培养大约6个月以上。通常认为鸟细胞在传代大约20-25代后为永生化。永生化细胞与转化细胞的区别在于，不象转化细胞，永生化细胞是密度依赖的和/或生长停滞(如接触抑制)的。转化细胞能够在软琼脂中生长，注入试验动物后通常能够形成肿瘤。本专利技术的细胞可用作培养毒或表达重组蛋白或病毒的基质，特别是强调细胞不含污染病毒或病毒蛋白时。该细胞也可用于研究细胞衰老和永生化的内在机制。来自10日龄ELL-0卵的鸡胚成纤维细胞(CEF)原代细胞通过以下方法获得取10日龄胚胎躯干，将组织绞碎，将细胞置于培养物中。受精卵获自Hy-Vac(Adel，Iowa)。卵及产卵者由供应商证实无禽流感病毒(A型)、禽呼肠病毒、禽腺病毒(I-III群)、禽脑脊髓炎病毒、禽痘病毒、新城疫病毒、副粘病毒(2型)、支原体、沙门氏菌和其它已知感染家禽原种的感染因子。原代细胞的分离和永生化细胞的鉴定见实施例1。进行细胞鉴定是因为发现永生化细胞时，要对细胞群体进行选择以研究细胞衰老的影响。已知人和禽细胞在组织培养条件下是最难永生化的细胞。不象啮齿动物细胞，未见有来自正常供体的人或鸡成纤维细胞永生化的方法报导(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：D·N·福斯特，L·K·福斯特，
申请(专利权)人：明尼苏达大学评议会，
类型：发明
国别省市：