本发明专利技术涉及一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，属于生物制品技术领域，所述方法包括：1）种细胞的制备，2）生物反应器的准备，3）PK-15细胞悬浮培养，4）PK-15细胞悬浮培养病毒，5）细胞悬浮病毒培养及连续收获，6）病毒液培养周期及收获量。本发明专利技术逾越了转瓶生产工艺存在的多种技术瓶颈，提供了一种利用片状载体悬浮培养PK15细胞，获得高效、可持续性、大规模生产高滴度圆环病毒2型（PCV2）病毒液的工艺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，属于生物制品
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技术介绍
圆环病毒病感染是近年来发现的一种比较难控制的传染病。该疾病主要侵害哺乳仔猪和育肥猪，及怀孕母猪。其特征性临床症状为患猪体质不良，皮肤苍白。引起的疫病包括猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，增生性坏死性肺炎(PNP)、猪皮炎与肾病综合征(TONS)、猪呼吸系统疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性震颤及肠炎等。同时PCV-2感染产生的免疫抑制极易引发其它病原混合感染或继发感染。2006、2007年，猪圆环病毒在中国猪“无名高热症”发生中起着重要的诱因作用。目前，圆环病毒病在我国已普遍发生，表现为流行范围广、阳性率高、混合感染严重、种猪感染率高等特点，给我国养猪业造成严重的经济损失。由于本病的危害日益严重，已引起人们的密切关注，养猪行业人士更将其列为当前危害养猪业发展的头号疫病。疫苗免疫是预防该病发生的最有效方法之一。使用生物反应器大规模培养细胞，获得高病毒含量抗原，是当前生物制品生产和疫苗行业发展的主流模式和 必然趋势。使用生物反应器比传统的转瓶培养工艺具有不可比拟的优势，比如:利于对污染和内毒素的控制，大幅度提高细胞密度和毒液抗原含量，抗原批间次差异小，培养基血清含量低，疫苗质量均一，疫苗注射反应小、免疫抗体水平高、整齐、免疫持续期长，减少对厂房面积的需求，减少对人力的依赖，可以实现远程监视与控制等常规细胞培养所不具备的多种技术优势。目前，国内常规生产猪圆环病毒2型(PCV2)工艺主要是转瓶生产培养，产出的PCV2的病毒滴度均在105_°左右，利用生物反应器及片状载体生产工艺，可提高PCV2病毒产量和滴度，可以产出滴度高达106_5TCID5tZml以上的病毒液，病毒产量是传统转瓶工艺的100倍左右。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，本专利技术逾越了转瓶生产工艺存在的多种技术瓶颈，提供了一种利用片状载体悬浮培养PK15细胞，获得高效、可持续性、大规模生产高滴度圆环病毒2型(PCV2)病毒液的工艺。，包括以下步骤:I)使用转瓶培养制备密度为2~3X IO5个/mL的PK-15细胞液；2)于生物反应器内接种所述细胞液，加入片状微载体，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，进行细胞悬浮培养，其中:每接种IL的所述细胞液，加入所述片状微载体250g，然后补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4~5L ;3)接种细胞24小时后进行灌注培养，设定搅拌转速为85~100转/分，溶氧为40~50%，pH 为 7 ~7.2，温度为 36.8 ~37.3°C ；4)所述PK-15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型(PCV2)，病毒接种量为生物反应器培养基8% (V/V)，并同时加入终浓度为2mmol/L的D-氨基葡萄糖，所述生物反应器参数设置为90~100转/分，溶氧为50~55%，pH为7.2~7.4，温度为36.4~36.8 0C ； 5)所述猪圆环病毒2型(PCV2)病毒接种24小时后至240小时采用灌注工艺培养，使用体积百分比为1%的牛血清培养基进行灌注，生物反应器参数与步骤4)相同，其中:所述步骤2)中每接种IL的所述细胞液，此步骤中灌注量为平均每天15L ；6)所述猪圆环病毒2型(PCV2)病毒接种后240~360小时停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，反复冻融两次，冻融过程中不断摇晃，即得猪圆环病毒2型(PCV2)病毒液。以5L工作体积为例，本专利技术一个PK-15细胞悬浮培养猪圆环病毒2型(PCV2)周期为13天,共收获病毒液量约150L左右。其中，所述生物反应器可选用美国NBS公司生产的7.5L生物反应器，所述片状载体可选用美国NBS的Fibra-Cel Disks。优选的，所述的步骤3)中培养条件为:搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为7.2，温度为37。。。优选的，所述的步骤4)中的培养条件为:搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为7.4，温度为 36.50C ο优选的，所述的步骤5)中的培养基中牛血清的质量百分含量为1%。更优选的，所述的步骤6)中病毒培养收获时间为病毒接种后240小时。与现有的生产工艺相比，本研究是通过新型的生物反应器及片状载体进行高效地培养高密度细胞以及高滴度的PCV2病毒液，从而为生产高质量的PCV2疫苗奠定基础。本专利技术具有以下优点:1.有效降低劳动强度:以7.5L生物反应器为例，该生物反应器的工作体积为5L，载体装量为250g，载体表面所提供的细胞贴壁的面积与80个15L转瓶相当，从而可有效减少常规生产工艺中转瓶培养所需要的劳动强度。2.操作简便、培养参数可控制:本专利技术所涉及的生产工艺仅需I个人就可以完成，可实现病毒繁殖的机械化、自动化、精确化培养，每批次病毒滴度稳定，批间次各项技术指标差异小，更易实现病毒生产的标准化管理。而传统工艺则需要80个15L的转瓶或至少5人才能完成，基本手工操作完成，人为及不确定因素影响较大即生产的病毒液质量随PK-15细胞生长状况不同，出现较大差异。3.提高病毒产量与滴度:与传统生产工艺相比，该方法可以很大程度上扩大生产规模，以5L工作体积为例,本专利技术一个培养周期可以生产150L的病毒液,而传统工艺仅能生产约50L。传统生产工艺产出的PCV2的滴度仅为105_°TCID5Q/ml左右，而本专利技术使用的生物反应器及片状载体生产工艺可以产出滴度高达106_ 5TCID5ciAil的病毒液，即PK-15细胞悬浮培养工艺培养病毒，一个培养周期病毒产量是传统工艺的100左右。4.生产成本降低:传统的生产工艺中所使用的培养基中血清的浓度均较高，细胞扩繁需10%血清，病毒繁殖扩增需2%血清，而本专利技术中细胞吸附于片状载体及扩繁需5%血清，接毒后所维持液中血清含量仅为1%，与传统生产工艺相比大大降低生产成本。5.生产空间小、密闭、不易造成生产和环境的双重污染:同等病毒抗原产量，悬浮培养工艺生产线空间是传统转瓶生产线的1/5 ;细胞悬浮培养生产病毒是在密闭容器中进行，不易引发外界环境或人为操作不当造成的产品污染及对环境的生物安全隐患。【具体实施方式】以下为对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1，PK-15细胞培养圆环病毒生物反应器培养工艺研究该方法具体有以下步骤组成:1 材料1.1细胞PK-15细胞(无PCV-1污染)由扬州优邦生物制药有限公司扩繁并保存。1.2毒种PCV-2 (YZ株)F15代由扬州优邦生物制药有限公司扩繁并保存。1.3培养基及试剂DMEM购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone公司；D_氨基葡萄糖购自BBI公司；PCV-2阳性血清购自VMRD公司；羊抗猪荧光二抗购自SouthernBiotech公司；其它试剂均为国产分析纯级。1.4仪器7.5L生物反应器及配套片状载体购自NBS公司；倒置荧光显微镜购自Nikon公司；细胞转瓶机购自兰飞公司。2 方法2.1生物反应器的准备7.5升反应器的工作体积为5升，载体使用量为250g/罐/次，载体表面积为12本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：1）使用转瓶培养制备密度为2～3×105个/mL的PK?15细胞液；2）于生物反应器内接种所述细胞液，加入片状微载体，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，进行细胞悬浮培养，其中：每接种1L的所述细胞液，加入所述片状微载体250g，然后补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4～5L；3）接种细胞24小时后进行灌注培养，设定搅拌转速为85～100转/分，溶氧为40～50%，pH为7～7.2，温度为36.8～37.3℃；4）所述PK?15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型（PCV2），病毒接种量为生物反应器培养基8%（V/V），并同时加入终浓度为2mmol/L的D?氨基葡萄糖，所述生物反应器参数设置为90～100转/分，溶氧为50～55%，pH为7.2～7.4，温度为36.4～36.8℃；5）所述猪圆环病毒2型（PCV2）病毒接种24小时后至240小时采用灌注工艺培养，使用体积百分比为1%的牛血清培养基进行灌注，生物反应器参数与步骤4）相同，其中：所述步骤2）中每接种1L的所述细胞液，每天加流灌注量为15L；6）所述猪圆环病毒2型（PCV2）病毒接种后240～360小时停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，反复冻融两次，冻融过程中不断摇晃，即得猪圆环病毒2型（PCV2）病毒液。...
【技术特征摘要】
1.一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤: O使用转瓶培养制备密度为2~3X IO5个/mL的PK-15细胞液； 2)于生物反应器内接种所述细胞液，加入片状微载体，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，进行细胞悬浮培养，其中:每接种IL的所述细胞液，加入所述片状微载体250g，然后补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4~5L ; 3)接种细胞24小时后进行灌注培养，设定搅拌转速为85~100转/分，溶氧为40~50%, pH 为 7 ~7.2，温度为 36.8 ~37.3°C ; 4)所述PK-15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型(PCV2)，病毒接种量为生物反应器培养基8% (V/V)，并同时加入终浓度为2mmol/L的D-氨基葡萄糖，所述生物反应器参数设置为90~100转/分，溶氧为50~55%，pH为7.2~7.4，温度为36.4~36.8V ； 5)所述猪圆环病毒2型(PCV2)病毒接种24小时后至240小时采用灌注工艺培养，使用体积百分比为1%的牛血清培养基进行灌注，生物反应器参数与步骤4...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱钟，潘杰，宋庆庆，李群，徐萍，
申请(专利权)人：扬州优邦生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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