产生非节段负链RNA病毒的细胞和方法技术

本发明专利技术涉及从克隆的脱氧核糖核酸（ｃＤＮＡ）特别是从麻疹病毒，特别是从减毒株例如批准用于接种的减毒株，特别是从减毒的Ｓｃｈｗａｒｚ麻疹病毒和各种基于重组Ｓｃｈｗａｒｚ麻疹病毒且表达异源序列的病毒产生非节段单链负义ＲＮＡ病毒（ＮＮＶ或单分子负链ＲＮＡ病毒目）的重组细胞以及方法。这些拯救的病毒可在扩增后用作免疫麻疹和／或免疫表达的异源肽或蛋白质的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生非节段负链RNA病毒的细胞和方法
本专利技术涉及从克隆的脱氧核糖核酸(cDNA)特别是从麻疹病毒，特别是 从减毒株例如批准用于接种的减毒株，特别是从减毒的Schwarz麻疹病毒 和各种基于重组Schwarz麻疹病毒且表达异源序列的病毒产生非节段单链 负义RNA病毒(NNV或单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales))的重组 细胞以及方法。这些拯救的病毒可在扩增后用作免疫麻疹和/或免疫表达的 异源肽或蛋白质的疫苗。减毒活RNA病毒可制备为高效疫苗。在这些疫苗当中，麻疹疫苗已应 用于数亿儿童，并已证实是安全有效的。注射一到两次后，该疫苗可诱导 终身免疫。它很容易在大多数国家以低成本大规模生产。这些优点使得麻 疹病毒尤其是减毒疫苗株成为免疫儿童和(甚至在某些情况下)成人使其抵 抗麻疹和/或其他感染性病原体尤其是病毒性病原体例如AIDS(反转录病 毒)、黄病毒或冠状病毒(SARS)病的良好候选载体。自20世纪60年代以来，减毒活麻疹病毒已被用作疫苗，是最有效和 最安全的人疫苗之一。大规模接种疫苗在发达国家可有效地控制麻疹。但 是，由于疫苗在发展中国家分布不足，仍有大约4500万人感染麻疹，每年 导致700,000名儿童的死亡。因此WHO己加大其针对接下来10-20年的全 球疫苗接种项目的投入力度(C.D.C.， 2005)。利用WHO的活动，采用安全 有效的新多价小儿疫苗特别是双价小儿疫苗，使用源自麻疹疫苗的疫苗载 体可在世界上某些地区为J L童进行麻疹或其他传染性疾病的同时免疫。麻疹病毒(MV)属于副粘病毒科麻疹病毒属。它是一种具有非节段负链 RNA基因组(15，894 bp)的包膜病毒。麻疹仅可感染一次，因为免疫系统启 动了强特异应答，并建立了终身记忆，避免发生重新感染。这种保护基于 抗体生成和记忆细胞毒性CD8+ T淋巴细胞(CTL)。病原株强烈破坏血细胞 生成(Arnebom等人，1983; Kim等人，2002; Okada等人，2000)，从而形 成短暂的免疫抑制，而后者是发展中国家因麻疹感染所引起的大多数死亡 的原因。与原始毒株相比，减毒株不会诱导免疫抑制(Okada等人，2001)。101954年通过人原代细胞培养分离得到麻疹病毒的Edmonston株(Enders 等人，1954)。经改造用于鸡胚成纤维细胞后，通过随后在鸡胚成纤维细胞 中传代，得到了毒性进一步减弱的疫苗毒种。具有相同核苷酸序列的 Schwarz株和Moraten株组成了最常使用的麻疹疫苗(Parks等人，2001a; Parks等人，2001b)。经一到两次注射进行接种可诱导终身免疫(Griffm等 人，2001; Hilleman等人，2002)。巳证实CD8细胞和抗体可在接种后存在 多达25年(Ovsyannikova等人，2003)。麻疹疫苗在大多数国家容易投入大 规模生产，且可以低成本制备。病毒基因组的减毒源自多个突变的有利组 合。因此，该疫苗非常稳定，至今从未观察到疫苗株的回复突变(Hilleman 等人，2002)。此外，该病毒仅在细胞质内复制，避免了整合到宿主基因组 染色体上的任何风险。这些特征使得减毒活的麻疹疫苗成为开发多价疫苗 载体的出色候选物。出于该目的，已克隆出对应于Edmonston B MV株反 基因组的感染性cDNA，并建立起可产生相应病毒的反求遗传学技术。专利技术人之前使用世界上最常使用的麻疹疫苗Schwarz MV已开发出一 种载体(Combredet等人，2003)。该载体可在12次以上的传代过程中稳定 表达许多基因或大基因的组合。产生含4,000-5,000个附加核苷酸的重组 MV载体，表示附加的30%基因组。通过细胞培养产生滴度堪比标准MV 的这些病毒。传代12次和102()的扩增系数后，96%以上的感染细胞继续表 达附加基因。同样在单分子负链RNA病毒目的其他成员中观察到的这种极 为稳定的表达，很可能是因为没有这些螺旋核衣壳病毒对基因组大小的几 何限制，这点不同于具有二十面体衣壳的病毒。而且，MC感染免疫系统 的细胞(巨噬细胞和树突细胞)，从而将货物抗原直接传递给最有效的抗原呈 递细胞，而这是疫苗载体的主要优点。最后，MV基因组很小，因此避免 对该载体的应答超过对转基因的应答。基于减毒株的安全性和有效性最终取决于其基因组序列的假设，专利技术 人克隆了对应于Schwarz/Moraten麻疹病毒反基因组的感染性cDNA，其中 麻疹病毒来自于从工业制备的Schwarz疫苗纯化的病毒颗粒，其中该疫苗 以最优步骤制备以保持保真性(Combredet等人，2003)。为了优化反求遗传 学系统的产量，反基因组病毒cDNA置于T7噬菌体RNA聚合物启动子和 实现最佳效应所需的附加GGG基序的控制下。为了实现病毒RNA的精确 切割，在GGG基序和第一个病毒核苷酸之间插入锤头状核酶，而来自丁型肝炎病毒的核酶置于最后一个病毒核苷酸的下游。使用基于人辅助细胞转染的前述反求遗传学系统，形成的pTM-MVSchw质粒可产生对应的病毒 (Radecke等人，1995)。为了防止重组疫苗适应非许可的细胞，以cDNA转 染的辅助细胞与鸡胚成纤维细胞共培养，其中最初在鸡胚成纤维细胞中选 择病毒，现在则在鸡胚成纤维细胞生成该病毒。重组病毒传代数次后，发 现其整个基因组的序列与最初序列相同(Combredet等人，2003)。在转基因 小鼠和猕猴上评价从pTM-MVSchw质粒拯救的病毒的免疫原性，并将其与 工业生产的Schwarz疫苗进行比较。所有接种的猕猴均形成了抗MV的抗 体并发生了特异细胞应答。没有观察到cDNA生成的Schwarz病毒与原疫 苗之间的差异，这表明克隆的病毒具有与亲代疫苗相同的免疫原性 (Combredet等人，2003)。这种分子克隆可产生Schwarz麻疹疫苗，而无需依赖病毒留种。在基因组的不同位点弓I入附加的转录单位(ATU)对pTM-MVSchw质粒 进行修饰，以用于表达外源基因。这些ATU是插入到例如病毒基因组的一 个基因间N-P区的多克隆位点盒(含有转录所需的顺式作用元件)。增强型 绿色荧光蛋白(eGFP)基因插入到该盒内。在pTM-MVSchw质粒的两个位置 引入ATU(P基因和M基因之间以及H基因和L基因之间)。不考虑附加的 序列，反基因组核苷酸的总数必须保持为6的倍数，以符合优化病毒复制 的"6核苷酸规则"(Calain等人，1993)。 GFP转基因在所有的受感染细胞类 型中表达，从而证实重组Schwarz麻疹病毒发挥了载体的作用。该载体允 许基于目前在全球使用的批准减毒活疫苗株来设计组合疫苗。这种工作是 国际申请WO 2004/000876的目的，该申请通过引用的方式纳入本文。大规模利用这类基于MV的重组活疫苗取决于它们在许可细胞(例如原 代鸡胚成纤维细胞(CEF)或人二倍体MRC5)内稳定和高滴度生长的可能性。 与产生高滴度病毒的实验细胞系例如非洲绿猴Vem细胞相比，这些细胞通 常产生中等滴度的MV。因此，必须获得相对高滴度的初始毒种。以反求 遗传学从cDNA产生这种初始毒种。虽然在其改造的感染性cDNA或DNA转染适宜细胞后可容易在体外 得到正链本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定产生至少ＲＮＡ聚合酶、非节段负链ＲＮＡ病毒核蛋白（Ｎ）和非节段负链ＲＮＡ病毒磷蛋白（Ｐ）或它们的功能衍生物的细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：F坦吉，P沙尔诺，Y雅各布，
申请(专利权)人：巴斯德研究院，国立科学研究中心，
类型：发明
国别省市：FR[法国]