重组的感染性不分节段的负链RNA病毒制造技术

本发明专利技术提供了完全从ｃＤＮＡ克隆中产生感染性复制性不分节段的负链ＲＮＡ病毒的方法。这一方法提供了通过重组ＤＮＡ技术将突变引入该病毒基因组中的可能性。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种遗传工程得到的感染性复制性不分节段的负链RNA病毒突变体，和这种突变体的制备方法。狂犬病病毒(RV)是棒状病毒科的不分节段的负链RNA病毒的一个实例。属于此科的其它病毒种为水泡性口炎病毒(VSV)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)，病毒性出血性败血病病毒(VHS，Egtved病毒)，牛暂时性发热病毒(BEFV)，和苦苣菜黄网病毒(SYNV)。除棒状病毒科以外，属于副粘病毒(如sendai病毒(SV)，2型和3型副流感病毒(PIV)、新城疫病毒(NDV)、流行性腮腺炎病毒(MUV)、麻疹病毒(MEV)和犬热瘟病毒(CDV)和丝状病毒科的病毒，以及几种未归于某科的病毒(如Borna病病毒；BDV)均具有不分节段的负链RNA基因组。各类的不分节段的负链RNA病毒中全基团结构是有可比的。特别是在副粘病毒和棒状病毒之间，在全基因结构上仅有很小的区别(Tordo等，Seminars in Virology 3341-357，1992)。RV可感染所有温血动物，在出现症状后这种感染最后几乎都导致死亡。犬狂犬病在世界上许多地方仍很重要全世界每年发生的约75,000例人狂犬病例的大部分是由感染的狗引起的。在欧洲许多国家、和在美国加拿大，野生动物狂犬病的重要性日益增加。在大部分物种中，狂犬病的临床特征相似，但在个体间存在很大的差异。在被狂犬病动物咬伤后，潜伏期一般为14-90天，但也可以相当长，有潜伏期超过一年的记录。该疾病的两个临床形式为狂暴性和早瘫性或麻痹性。在狂暴性形式中，动物变得不安、烦燥、富攻击性，并且通常是危险的，因为它失去了对人的一切恐惧，会咬任何引起其注意的东西。该动物经常不能吞咽，引起该病的症状“恐水症”。经常有过量的唾液、对光和声反应过度、及感觉过敏。随着脑炎的发展，瘫痪取代了狂暴，如从该病的早瘫性形式的全过程中所见，动物显示相同的临床特征。最后，常有抽搐发作、昏迷、和呼吸停止，临床症状开始后2-7天发生死亡。当被狂犬病动物咬伤或偶发的抓伤，或当狂犬动物的带病毒唾液进入伤口时，狂犬病毒进入体内。在咬伤部位(肌肉)中病毒复制后，开始侵入外周神经末稍，及病毒基因组在轴突胞浆中向中枢神经系统运动。病毒进入脊髓再进入脑(特别是缘系统)与神经障碍的临床症状有关。一般，大约在中枢神经系统感染引起狂暴的同时，病毒颗粒从唾液腺中的粘液分泌细胞的顶端散发出来，以高浓度运送至唾液中。在狂犬病的整个过程中，仅轻微地激起宿主炎症和特异的免疫应答；对此最合理的解释是因为此感染在肌肉中和在神经细中是非致细胞病变的，而且因为此感染大量集中在神经系统的免疫隐蔽区中。像所有的棒状病毒那样，RV病毒由两个主要结构成分组成核衣壳或核蛋白(RNP)核心和围绕RNP核心的双层膜形式的包膜。所有棒状病毒的感染性成分为RNP核心。此基因组RNA是反义的，因此不能作为信使，但要求其自身内源性RNA聚合酶转录mRNA。核衣壳(N)蛋白结合两种小蛋白(即RNA依赖性RNA聚合聚(L)和磷蛋白(P))包装此RNA基因组，形成RNP核心。膜部分含两种蛋白质跨膜糖蛋白(G)和位于膜内侧的基质(M)蛋白。G蛋白在RV中负责细胞附着和膜融合，另外还是宿主免疫系统的主要靶点。在转录过程中，此基因组指导一短的先导RNA和含5个单顺反子的、加帽的多聚腺苷化的mRNA的序列合成。在复制过程中，顺反子间的条件性转录终止和启动信号不被病毒聚合酶所识别。对于转录酶反应和复制酶反应，都要求与RNA基因组复合的N-蛋白以及L-蛋白和P-蛋白的存在。已测定了RV基因组上的基因顺序，其为如图1所示的3’-先导序列-N-P-M-G-L-5’。转录后，RV的每个mRNA立即被翻译。与复制过程中相继发生两个过程先产生与基因组互补的衣壳化的完整的正链RNA，然后产生同样由N、L和P蛋白衣壳化的完整的负链RNA。最后，新组成的RNP核心在组装和芽殖过程中与M-蛋白及G-蛋白结合，导致装配好的感染性RV病毒颗粒的释放。11.9Kb的基因组RVRNA含有5个开放阅读框架(ORF)，编码N、P、M、G和L蛋白，另外在G和L基因之间存在假基因区(ψ)(图1)。对不分节段的负链RNA病毒的现代疫苗包含化学灭活病毒疫苗或含减毒的病毒株的改造的活病毒疫苗，其中减毒病毒株的致病性已经细胞培养中的多次传代而减低。化学灭活的狂犬病疫苗有，如Rabivac，Behringwerke(人)，HDC，Rhone-Poulenc(人)，Bayovac-LT，Bayer(兽)，Madivac，Hoechst(兽)，Epivax-LT，Pitman-Moore，Rabisin，Phone-Merieux。对于RV，这种减毒病毒的实例有疫苗株SAD B19和ERA。灭活的疫苗一般仅诱导低水平的免疫，要求重复免疫接种。另外，经灭活处理后，诱导病原体的抗原决定簇的中和作用可能改变，从而减低的疫苗的保护能力。一般优选减毒活病毒疫苗，因为它们激发常基于体液和细胞反应的免疫应答。但在细胞培养传代过程中，可能向病毒基因组中引入不可控制的突变，从而产生不同的毒力和免疫特性的病毒颗粒群。在细胞培养传代过程中过度减毒也是这些疫苗的一个问题。必须取得保证疫苗为无毒的和确保其仍有保护性之间的微妙平衡。另外，人们已知这种传统的减毒活病毒疫苗可能回复毒力，在接种动物中引起疾病暴发，并可能将病原体扩散到其它动物中。另外，活病毒疫苗的一个问题是，抗原组分间的相互影响导致一种或多种组成成分的效力下降。更进一步讲，对于现今施用的活的减毒RV疫苗或灭活的RV病毒，不可能确定某具体动物是RV类病毒携带者，还是已接种的动物。因此，能够区别用RV疫苗接种的动物和被该类病毒感染的动物是很重要的，以便采取适当的措施减小有毒的病毒的扩散。在某RV(糖)蛋白的编码基因中产生突变，能够引入例如血清学上可鉴别的标记，该蛋白一般在被感染宿主动物中引起抗体的产生。希望以可控制的方式向RV RNA基因组中引入突变，以便例如形成的突变体RV是减毒的，或含有编码外源蛋白如免疫标记蛋白或病原体抗原的异源核酸序列。为此目的，在DNA病毒和正链RNA病毒中已广泛使用了重组DNA技术。重组的DNA病毒实例有Aujeszky病毒(PRV)；腺病毒；牛痘病毒。重组的正链RNA病毒的实例有α-病毒(Sindbis V.，Semliki forest virusH.V.Huang，C.M.Rice，C.Xiong，S.Schlesinger(1989)作为基因表达载体的RNA病毒。Virus Genes 3，85-91)，微小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、A型肝炎病毒、口蹄疫病毒J.W.Almond和K.L.Burke(1990)，脊髓灰质炎病毒作为递呈外源抗原的载体，Semin.Virol.1，11-20)。RNA病毒基因组的定向遗传工程取决于产生能被特异RNA-依赖性RNA聚合酶接受作为模板的重组RNA的能力。用许多标准的DNA依赖性RNA聚合酶(如T7RNA聚合酶或细胞RNA聚合酶II)产生的转录本和模拟(mim-icking)病毒基因组为许多正链RNA病毒的聚合酶所识别。这使得可以从cDNA转录本中回收感染性病毒或复制子，应用重组DNA技术以位点特异性的方式对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种遗传工程产生的感染性复制性不分节段负链ＲＮＡ病毒突变体，其包括在病毒基因组的开放阅读柜架、假基因区或基因间区中的插入和／或缺失。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：KK松泽曼，
申请(专利权)人：卡尔克劳斯肯蔡尔曼，
类型：发明
国别省市：DE[德国]