用于神经细胞转移基因的负链RNA病毒载体制造技术

一种可向神经细胞内转移基因的负链ＲＮＡ病毒载体，它使向神经细胞，包括向基因治疗中的中枢神经系统组织，等等内高效率转移基因成为可能。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用病毒载体，更具体地说，是用一种负链RNA病毒载体转移基因的方法，此方法可用于神经细胞的基因治疗。目前基因治疗中普遍应用的病毒载体包括反转录病毒载体，单纯疱疹病毒载体(HSV)，腺病毒载体，腺病毒相关病毒(AAV)载体，等等。特别是，随着应用核磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描术(PET)分析脑功能的新进展，对既能有效感染非分离神经细胞又能调节被感染细胞内转基因高水平表达的载体的需要不断增加。因此，腺病毒载体，单纯疱疹病毒载体，AAV,HIV等相当受重视。尽管曾报导HSV能够将一段基因转移至外周神经系统的神经节，但仍存在其表达量的问题(基因治疗，1995,2:209-217)。HIV感染神经细胞也已得到证实(自然生物技术，1997,15:871-875)。因为HIV基因组插入染色体的位置难以预测，所以有可能破坏正常基因，激活癌基因，以及使目的基因过度表达或表达抑制。AAV已经用于帕金森氏病的脑部治疗(实验神经病学，1997,144:147-156)和粘多糖病Ⅶ型的脑部治疗(ASGT meenting,1998，摘要号692)。然而，有报导帕金森氏病中导入塞酶林神经节的基因转移不完全，其粘多糖病Ⅶ型的脑内表达不足。目前腺病毒的应用最为普遍，有报导它能向海马锥体细胞层转移基因(自然医药(Nature Medicine),1997,3:997-1004)。但腺病毒有其缺陷，如细胞毒性和强免疫原性。另一方面，由于负链RNA病毒，如仙台病毒(此后简写作SeV)，不与染色体整合，因此不会激活癌基因。而且，因SeV是一种RNA病毒，所以它有许多优点，例如感染后短时间内表达蛋白质以及与腺病毒相比转基因产物能更高水平地表达。本专利技术者首先用SeV制备了携带多种外源基因的重组体病毒，SeV是一种典型的负链RNA病毒，由于其安全、方便而适用于做基因治疗的载体。随后，将这些重组体用于向神经细胞、脑组织等转移外源基因。结果，专利技术者们发现这些重组体的应用使外源基因有效地向神经细胞和脑组织中转移，而且，他们发现本项专利技术中的病毒载体的应用致使导入的外源基因高效表达。此外，转移入脑的本项专利技术的病毒载体呈现有限的增殖。换言之，在外源基因表达一定时期后载体的表达降低了。而且，应用本专利技术中病毒载体的基因治疗被用于β-葡萄糖醛酸酶缺陷型小鼠脑组织，并改善了该小鼠的症状。因此，本专利技术者们发现，所制备的病毒载体在那些治疗时需要对转基因表达进行调节的神经病的基因治疗中能有效发挥功能。在沙土鼠或小鼠脑室内给予携带FGF基因的本专利技术病毒载体导致载体感染室管膜细胞，降低了动物的食物摄入和体重。室管膜细胞形成细胞层，把脑组织与脑室分隔开，但在第三脑室脑脊液与下丘脑核紧密相互作用。既然本专利技术中的载体能有效感染室管膜细胞，可利用这些载体在脑室内表达分泌蛋白，使这些蛋白作用于下丘脑核(摄食中枢、饱中枢等等)。此外，在沙土鼠的缺血模型上，已发现导入一种在海马实质细胞内表达生长因子的病毒载体使细胞损伤明显减少，这说明了本专利技术中的病毒载体在防止脑缺血中细胞脱落引起细胞死亡方面的用途。这些事实已经说明本专利技术中的载体在多种临床治疗中用作向脑内转移基因的载体是实用的。本项专利技术涉及(1)一种向神经细胞转移核酸的方法，包括使神经细胞与负链RNA病毒载体或包含该载体的细胞相接触的步骤；(2)(1)中的方法，其中所述神经细胞为中枢神经系统细胞；(3)(2)中的方法，其中所述的中枢神经系统细胞为脑室的室管膜细胞；(4)(2)中的方法，其中所述的中枢神经系统细胞为海马细胞；(5)(1)至(4)中的任一种方法，其中负链RNA病毒载体所含的核酸包含外源基因；(6)(5)中的方法，还可使所述外源基因短暂表达；(7)(5)中的方法，其中所述的外源基因编码一种分泌蛋白；(8)(7)中的方法，其中所述蛋白质作用于下丘脑神经核；(9)(7)中的方法，其中所述蛋白质能够保护脑组织不被缺血损伤；(10)(5)中的方法，其中所述外源基因选自FGF-1,FGF-5,NGF,CNTF,BDNF,GDNF,p35,CrmA,ILP,bcl-2和ORF 150；(11)一种控制动物摄食行为的方法，此方法包括施予动物负链RNA病毒载体，此载体包含FGF-1或FGF-5作为外源基因；(12)一种控制动物血糖水平的方法，此方法包括施予动物负链RNA病毒载体，此载体包含FGF-1或FGF-5作为外源基因；(13)(1)至(12)中的任一种方法，其中所述负链RNA病毒属于副粘液病毒科；(14)(13)中的方法，其中所述属于副粘液病毒科的病毒是仙台病毒；和(15)一种负链RNA病毒载体，其通过应用(1)至(14)中的任一种方法用于向神经细胞内转移核酸。在此项专利技术中，“负链RNA病毒载体”包括一个复合体，此复合体由负链RNA病毒衍生并具有传染力。这里，“传染力”意思是“复合体将其核酸或其所包含的其他物质通过它与细胞膜粘附和融合的能力而转移入细胞的能力”。在此项专利技术中，负链RNA病毒载体可通过，例如，以负链RNA病毒作为起始物质而制备。用作起始物质的病毒如，属于副粘液病毒科的如SeV，新城疫病毒，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒和犬瘟病毒；属于正粘液病毒科的如流感病毒，属于弹状病毒的如水疱性口炎病毒和狂犬病病毒；等等。当应用SeV时，由NP,P/C和L三种基因编码的一组蛋白质，被认为是病毒自主复制必要的，它们不必依靠本专利技术中的病毒载体对其编码。例如，本专利技术中的载体能够在携带这组蛋白质基因的宿主细胞中增殖，因此这些蛋白质可由宿主细胞提供。此外，这些蛋白质的氨基酸序列与病毒的天然氨基酸序列不必完全相同。任何突变均可被导入，或者用其他病毒的同源基因置换，只要它们的核酸转移活性相同于或强于那些天然蛋白质的。而且，当应用SeV时，由M、F和HN基因编码的一组蛋白质，被认为对病毒的传播能力是必要的，它们不必依靠本专利技术中的病毒载体对其进行编码。例如，本专利技术中的载体能够在携带这组蛋白质基因的宿主细胞中生成，因此这些蛋白质可由宿主细胞提供。此外，这些蛋白质的氨基酸序列与病毒的天然氨基酸序列不必完全相同。任何突变均可被导入，或者用其他病毒的同源基因置换，只要它们的核酸转移活性等同于或强于那些天然蛋白质的。为向神经细胞内转移外源基因，要制备和应用一种复合体，它包含插入了外源基因的重组病毒基因组。此包含重组病毒基因组的复合体可在体外或体内通过转录修饰过的cDNA而获得，此cDNA源于前面提到的任意一种病毒或其重组病毒，然后重构该病毒。重构病毒的方法已经被开发(见WO97/16539)。此外，除了完整的SeV基因组，不完整的病毒如缺损干扰颗粒(DI颗粒)(病毒学杂志68,8413-8417,1994)，合成的寡核苷酸等等也可以用做组建复合体的成分。当用SeV做原料时，复合体可能包含全部三种基因，M、F和HN，它们与病毒的传播能力关系密切。但是，一般来说，即使包含全部M、F和HN基因的复合体转移入脑，在病毒颗粒形成后复合体可能仍不会显示传播能力，因为缺乏蛋白酶水解对SeV传播能力必需的F蛋白。这里，“传播能力”意思是“核酸通过感染或用人工技术转移入细胞后可以复制并指导形成传染性颗粒或它们本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种向神经细胞转移核酸的方法，包括使神经细胞与负链ＲＮＡ病毒载体或包含该载体的细胞相接触的步骤。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：福村正之，长谷川护，浅川诚，
申请(专利权)人：株式会社载体研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]