移植物抗宿主病的抑制制造技术

哺乳动物类患者为治疗骨髓源性疾病而进行的细胞移植治疗中产生的移植物抗宿主病，可通过至少将同种异体细胞移植成分中的Ｔ－细胞在体外以适当的剂量给予氧化应激而得到预防和减轻，例如用臭氧和氧气的混合气泡通过Ｔ－细胞悬液。此方法也包括在应用氧化应激的同时用紫外光照射细胞。氧化应激引起Ｔ－细胞内炎症因子生成减少和增殖反应减小。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术范围本专利技术涉及用于医学治疗的细胞成分，其制备方法及其在医学治疗中的用途。更特别地，本专利技术涉及在哺乳动物类患者，特别是人类患者中，用于减轻称作移植物抗宿主病的同种异体(allogeneic)骨髓移植术后并发症的细胞成分，以及制备这种成分物质的方法。移植物抗宿主病，GVHD，是一种免疫疾病，是限制为治疗无法治愈的血液系统恶性疾病的一些类型，如白血病，所使用的同种异体骨髓或干细胞移植(在此均指allo-BMT)成功和施行的主要因素。GVHD是一个全身性炎症反应，可导致宿主慢性疾病的产生和死亡。目前，同种异体移植总是冒着伴随GVHD的严重危险，即使供体与宿主具有很高的组织相容性。GVHD由供体T-细胞与全身分布的不相容的宿主抗原相反应所致，引起强烈的炎症。在GVHD中，识别供体与宿主间差异的供体成熟T-细胞全面激活。目前防止和治疗GVHD的方法包括给予药物如环孢菌素-A和皮质激素。这些有严重的副作用，必须长时间给药且对于给药和监控很昂贵。也曾试图应用T细胞消耗以防止GVHD，但这需要复杂和昂贵的设备和专业技术。T-细胞过度消耗导致严重的问题，骨髓干细胞灌输失败、造血重建失败、感染或复发。过多限制的T-细胞消耗残留下的细胞仍能够启动GVHD。其结果，目前治疗GVHD的方法仅在有限的供体和宿主结合中取得成功，以致不能给许多病人提供有效的挽救生命的治疗。本专利技术的目的是提供一种减轻接受同种异体-BMT的哺乳动物类患者GVHD并发症形成的方法。相应的，本专利技术的一个方面提供了一种哺乳动物类患者减轻骨髓性疾病并减轻因此而发生的移植物抗宿主病(GVHD)的治疗方法，它包括给予患者同种异体造血干细胞和同种异体T-细胞，至少部分上述T-细胞在给予患者前体外接受了氧化应激，以诱导其中细胞因子生成状态的改变和增殖反应的减小。本专利技术的另一个方面提供了一种哺乳类T-细胞群，特别是不含干细胞，所述的T-细胞在体外接受了氧化应激，在所述细胞内诱导细胞因子生成状态的改变和增殖反应的减小。本专利技术进一步提供了一种制备给予患骨髓性疾病病人的同种异体细胞群的方法，它包括在体外使富含在T-细胞内的供体细胞群接受氧化应激，以在所述T-细胞内诱导细胞因子生成状态的改变和增殖反应的减小。图3是对下面的实例4所得结果的描述。优选实例的描述本专利技术的方法涉及最初从供体中采集造血干细胞和T-细胞。这种细胞的优选来源是动员的供体外周血干细胞和T-细胞。外周血中的干细胞数量非常少，根据本专利技术的一个优选的操作方法是浓集供体外周血的干细胞群，然后提取供体的外周血作为干细胞和T细胞的来源，用上述的方法进行治疗，然后注入患者体内。在从供体中提取外周血前，给供体注射一个疗程的适当生长因子，连续几天，如5天，可达到浓集的目的。通过一个已知的程序，白细胞分离置换可从血中收集到合适的细胞部分，提取时，血浆和红细胞在一个密闭的流式系统中回到供体体内。含有干细胞(大约3％)和T细胞(大约40％)，以及B细胞，中性粒细胞和其他白细胞的白细胞收集液，可被处理以改变其中T细胞细胞因子的产生状态和减小增殖反应，然后根据本专利技术，作为细胞(外周血单核细胞)的整体采集注入到宿主体内。然而，供体T-细胞首选地从其它细胞中分离，使得仅有T-细胞接受氧化应激并给予患者，而给患者注入的干细胞与处理的T细胞分开。但是，在实际应用中，外周血单核细胞收集液对应激物的反应是满意的，无需进一步分离以游离T-细胞，这是一个困难而昂贵的步骤。特别优选分别给予干细胞。如果因某原因需要将整个白细胞收集部分进行氧化应激，以在其中的T-细胞部分内诱导前述的改变，然后将整个部分输给患者，优选的防止干细胞受到氧化应激任何损害效应的方法如下所述。在一个可供选择，但非优选的方法中，供体的整体骨髓可被用作本专利技术方法的T-细胞和干细胞来源。在过去，整体骨髓是同种异体骨髓移植方法通常的细胞来源，也确实可用在本专利技术方法中。然而，这对供体是一个不方便和不适的方法，需要麻醉和较长的抽提过程。原则上，供体的任何T-细胞和干细胞来源均可用，但富含干细胞和T-细胞的外周血在临床上是最方便的。在本专利技术方法中T-细胞内诱导的细胞因子生成状态的改变优选炎症细胞因子生成的减少，如干扰素-γ和组织坏死因子-α。氧化应激可通过将T-细胞置于氧化环境而实施，如添加气态、液态或固态的化学氧化剂(臭氧、分子氧、臭氧/氧混合气、高锰酸盐、高碘酸盐、过氧化物、通过氧化机制作用于生物系统的药物，如阿霉素，以及类似物)。根据本专利技术的一个优选方法，悬液状态的T-细胞接受气态氧化剂，如臭氧/氧混合气泡通过细胞悬液，可选择与同时对细胞进行适当剂量的紫外照射相结合。根据本专利技术的一个方法，对来自供体的同种异体白细胞，包括干细胞和T-细胞，进行氧化应激。这消除了将T-细胞与白细胞组份中的其它细胞成分分开所需要的复杂和费钱的步骤。但是，这种情况下，特别优选的是要防止组份中的干细胞受到应激的有害影响。这可通过在接受应激时，在细胞组份中含有一种或多种干细胞生长因子而实现。氧化应激对干细胞的有害作用可通过生长因子存在而得到防护，因此，在干细胞-T-细胞组分接受氧化应激前，一种或多种干细胞生长因子被加进组分中。用在方法中的干细胞生长因子是在此应激过程中促进干细胞(而非T-细胞)生存的细胞因子。它们是与干细胞上生长受体相作用的细胞因子。它们被确信可激活细胞的MAP-激酶通路，导致erk活化。这种适合的生长因子的实例包括干细胞特异的生长因子、kit-配体、IL-3、GM-CSF和FLT3配体，它们均是已知的。优选添加精确剂量的提取和纯化的生长因子，或特别是市场上可买到的重组生长因子，或两者结合，适当地溶解或悬浮于适宜的、生物学可接受的液体中。根据本专利技术的一个给同种异体T-细胞氧化应激的优选方法包括，将细胞悬液置于医用级的氧气和臭氧中，例如含有臭氧作为较小成分的医用级氧气流沸泡经过细胞悬液。悬浮介质可以是任何通用的生物学可接受的媒介，它保持细胞处于有活力的状态。臭氧气可由本领域内已知的传统来源提供。气流中适合的臭氧含量约为1.0-100μg/ml，优选3-70μg/ml，最优选约为5-50μg/ml。给予液体中的气流速度为每分钟大约0.01-2升，优选每分钟0.05-1.0升，最优选每分钟大约0.06-0.30升(STP)。另一个给予T-细胞氧化应激使之适合在本专利技术中使用的方法，是在细胞悬液中加入生物学可接受的剂量的适当的生物学可接受的化学氧化剂。高锰酸盐、高碘酸盐和过氧化物在适量使用时是适合的。为实用的原因，过氧化氢在显示本专利技术方法的有效性和指导所用氧化剂的合适剂量中是有用的，尽管它不是本专利技术的首选药物。因此，适合的氧化剂剂量是浓度从1mmol到2mmol的过氧化氢，与含10-6-10-8细胞/ml的细胞悬液10ml接触20分钟，或来自不同氧化剂的相当的氧化应激。最佳的是约1mmol过氧化氢在上述悬液中约20分钟，或计算给予细胞相应氧化应激程度的相当的另一个氧化剂。要接受氧化应激的细胞悬液的体积通常从大约0.1ml到大约1000ml，优选大约1-500，含有随后给予进行同种异体-BMT病人的适合数量的T-细胞。这些数量通常与以前的方法中同种异体-BMT相关的同种异体T-细胞输入所需的数量相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备同种异体细胞群的方法，所述同种异体细胞群用于给予患有通过骨髓移植术而可能治疗的骨髓疾病的病人，该方法包括体外给予富含Ｔ－细胞的供体细胞群以氧化应激，在所述的Ｔ－细胞内，诱导改变的细胞因子生成状态和减小增殖反应。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：DE斯潘内，
申请(专利权)人：瓦索根爱尔兰有限公司，
类型：发明
国别省市：IE[爱尔兰]