一种与白血病相关的环状circRNA-005365基因及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种白血病相关的环状circRNA‑005365基因及其用途，本发明专利技术首先证实环状circRNA‑005365基因的存在，通过检测全身辐照病人中该基因表达情况，发现其表达水平显著下调。circRNA_005365可通过“海绵作用”吸附miR‑20a，因此该circRNA水平降低将导致细胞内游离的miR‑20a水平升高，miR‑20a对IL‑6基因表达的抑制作用加强。IL‑6在造血调节中发挥中重要作用，且与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生密切相关。研究组将转染了过表达环状circRNA‑005365基因的腺病毒载体的骨髓基质细胞与转染了空载体的对照骨髓基质细胞相比，发现转染组IL‑6水平明显低于对照，因而环状circRNA‑005365基因及其表达产物可作为预测造血干细胞移植后aGVHD的标记物，也可以作为治疗白血病的靶基因和用于制备治疗白血病的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种与白血病相关的环状circRNA-005365基因及其用途。
技术介绍
骨髓移植(Bonemarrowtransplantation，BMT)目前仍是各种血液系统恶性肿瘤、再生障碍性贫血、重度地中海贫血以及一些先天性免疫缺乏症或代谢性疾病的根本治疗方法。急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease，aGVHD)是异基因造血干细胞移植后常见并发症。尽管对于移植免疫的认识在不断进步,但aGVHD仍然是异基因造血干细胞移植后病人死亡的主要原因之一。环状RNA(circularRNA，circRNA)是一类在哺乳动物细胞中广泛存在的、对基因表达具有调控作用的内源性RNA分子。circRNA多定位于细胞质，具有miRNA应答元件(microRNAresponseelement，MRE)，能与miRNA相互作用。circRNA能够瞬间结合或释放大量miRNA，从而高效地发挥其调控作用。circRNA广泛参与体内各种基因表达的调控，包括移植后排斥反应的调节。因此，circRNA可能是防治白血病骨髓移植患者aGVHD发生的新靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种环状circRNA-005365基因，该基因及其表达产物可作为预测造血干细胞移植后aGVHD的标记物，作为治疗白血病的靶基因和用于制备治疗白血病的药物。本专利技术发现白血病患者经全身放疗后骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)中环状circRNA-005365基因表达显著下调，通过circRNABase预测该基因的应答元件中包括miR-20a。多项研究表明miR-20a可显著抑制白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)基因的表达。IL-6在造血调节中发挥中重要作用，且与急性移植物抗宿主病(aGVHD)的发生密切相关。综合文献和课题组研究结果，我们提出科学假设：circRNA-005365可通过“海绵作用”调节miR-20a水平，从而影响白血病患者体内IL-6含量，进而参与造血干细胞移植后aGVHD的调控。本专利技术第一个方面提供一种环状circRNA-005365基因，其cDNA序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术第二个方面提供环状circRNA-005365基因在制备诊断白血病的试剂中的应用。该环状RNA基因作为造血干细胞移植疗效的标记物。本专利技术第三个方面提供环状circRNA-005365基因在制备治疗白血病药物中的应用。本专利技术第四个方面提供检测所述环状circRNA-005365基因检测试剂盒，主要由DNA聚合酶、缓冲液、水、扩增引物对组成，所述的扩增引物对核酸序列如SEQIDNO：2，SEQIDNO：3所述。本专利技术第五个方面提供扩增环状circRNA-005365基因的引物对在制备诊断白血病试剂中的应用，所述的扩增引物对核酸序列如SEQIDNO：2，SEQIDNO：3所述。在本专利技术范围内，本专利技术的上述技术特征和下文实施例中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的技术方案，限于篇幅，在此不一一赘述。本专利技术首次证实了一个新的环状circRNA-005365基因的客观存在，通过检测全身辐照患者中该基因表达情况，发现其表达水平明显下降，该环状circRNA-005365基因及其表达产物可作为预测造血干细胞移植后aGVHD的标记物，为治疗白血病提供新的思路。含有该环状circRNA-005365基因及其引物对的试剂盒，可以用于aGVHD预测；环状circRNA-005365基因也可以作为预防aGVHD的靶基因，在白血病治疗中起到重大作用。附图说明图1正常组骨髓基质细胞中环状RNA芯片结果图；图2全身辐照处理组骨髓基质细胞环状RNA芯片结果图；图3正常组和全身辐照处理组骨髓基质细胞中环状RNA表达情况的聚类分析图；图中左侧为正常组骨髓基质细胞中环状RNA表达情况的聚类分析图，右侧为全身辐照处理组骨髓基质细胞中环状RNA表达情况的聚类分析图；图4内参GAPDH基因的实时定量PCR扩增曲线；图5circRNA-005365基因实时定量PCR扩增曲线；图6过表达cricRNA-005365基因腺病毒载体的骨髓基质细胞与正常组的IL-6水平比较。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定，本专利技术中所用的方法及其相关的试剂，可以有其他可选择和替代方案，能够达到相同技术结果即可。实施例1：扩增环状circRNA-005365基因引物对根据环状circRNA-005365基因SEQIDNO:1所示的cDNA序列，设计扩增用引物，各引物的具体序列见表1。表1环状circRNA-005365基因扩增引物序列引物名称序列(5’→3’)SEQ.IDFGAGGAGGAAGAACAGCCAAGC2RTGGCCTTCAATGCTCACAGC3上述引物人工合成后，作为扩增环状circRNA-005365基因cDNA序列引物对使用。实施例2：样品中总RNA的制备按照TRIZOL法RNA提取步骤，提取对照组、全身辐照处理组的骨髓基质细胞样品中的总RNA。简述如下：1匀浆样品按照TRIZOL法说明书，根据细胞数量，加入TRIZOL试剂后，匀浆；2两相分离匀浆后的样品在15-30℃孵育5分钟后，按照每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。3RNA沉淀将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mlTRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。4RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。5重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。6总RNA质量检测提取的总RNA，使用ND-1000测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。提取的总RNA质量、数质量应能满足后续试验的要求。实施例3：总cDNA序列的合成经质量检测合格的总RNA，按照下面所述的方法进行cDNA的合成。合成所用的试剂及其生产商如下：RNA酶抑制剂(Epicentre)；SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)；5×RT缓冲液(Invitrogen)；2.5mMdNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTestLtd)；Primer(英骏生物技术有限公本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环状circRNA‑005365基因，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
2016.10.21 CN 201610919732X1.一种环状circRNA-005365基因，其特征在于，其cDNA序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的环状circRNA-005365基因在制备诊断白血病的试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的环状circRNA-005365基因在制备诊断白血病的试剂中的应用，其特征在于，该环状RNA基因作为造血干细胞移植疗效的标记物。...

【专利技术属性】
技术研发人员：桂嵘，聂新民，黄蓉，张军华，江静，
申请(专利权)人：中南大学湘雅三医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43