抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类药物制造技术

本发明专利技术涉及抑制ＳＡＲＳ冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类抗病毒药物，所述药物的通式为：Ｘ－ＳＥＱ－Ｚ，其中ＳＥＱ表示ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．１～ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．２１所示的２１个氨基酸序列。经药效学实验测试，本发明专利技术的多肽类药物可抑制ＳＡＲＳ冠状病毒侵染宿主细胞。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗SARS冠状病毒药物，具体涉及抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类抗病毒药物。
技术介绍
SARS冠状病毒是引起2003年在我国和世界范围内爆发的“非典型肺炎”的病原体，目前还没有特效的药物能够治疗。SARS病毒是一种带囊膜的冠状病毒，其侵染细胞的第一步就是病毒囊膜与宿主细胞的融合。多肽类融合阻断分子因其能够阻断病毒囊膜与宿主细胞的融合，在其他病毒药物的开发研制中有着成功的经验，如HIV囊膜蛋白GP41有两段HR结构域，分别形成三个N螺旋和三个C螺旋。在HIV侵入细胞的过程中，这三个N螺旋和三个C螺旋形成Coiled-coil六聚体结构起着至关重要的作用。根据这一原理设计的多肽类药物T-20(商品名Fuzeon)已经上市，它能够有效地阻断由GP41本身的α螺旋形成六聚体，从而阻断HIV膜结构和细胞膜的融合。研究表明，T-20的阻断能力强，对机体副作用低，是一种理想的药物。SARS囊膜蛋白SPIKE的结构研究表明，在SPIKE蛋白中同样存在能够形成Coiled-coil结构的两段HR结构域。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发一类阻断SARS冠状病毒进入宿主细胞的抗病毒药物。本专利技术的技术方案是寻找可起到SARS冠状病毒多肽类融合阻断作用的物质，通过该物质与SARS囊膜蛋白Spike的相互作用，阻止SARS囊膜蛋白Spike的构型改变，从而阻断病毒囊膜与宿主细胞的融合，达到预防和治疗SARS病毒感染的目的。本专利技术提供的SARS冠状病毒多肽类融合阻断药物的具有如下通式X-SEQ-Z其中，SEQ表示SARS冠状病毒囊膜蛋白SPIKE中的多肽，所述多肽包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列。在SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列的多肽中至少一个氨基酸残基的连接使用非肽键连接方式，例如，以亚氨基、酯、肼、氨基脲或含氮化学键的形式连接；至少一个氨基酸残基以D构型存在；至少有一个氨基酸被另一个不同的氨基酸置换，所述置换方式是保守的和/或不保守的；所述多肽可以是SARS自然突变株相对应氨基酸位置的同源物；所述多肽可以被包含在一段其它多肽中；所述多肽可以以单体，二聚体，三聚体和多聚体的形式存在。X包括氨基、乙酰基，及某些疏水基团和大分子载体基团；Z包括羧基、氨基及某些疏水基团和大分子载体基团；所述疏水基团包括9-芴基甲氧羰基(9-fluorenyl methoxy-carbonyl)、苄氧羰基(carbobenzoxyl)1-二甲胺基萘-5-磺酰(dansyl)和叔丁氧羰基(t-butyloxy carbonyl)；所述大分子载体基团是共轭脂肪酸(Lipid-fatty acid conjuate)、聚乙二醇或碳水化合物类基团。上述通式中，X和Z也可以不存在。即，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列也可用作阻断SARS冠状病毒进入宿主细胞的抗病毒药物。本专利技术所述的多肽可以从真核细胞表达系统、原核细胞表达系统或固相化学合成的途径得到。在采用原核表达系统的实验中，先用PCR的方法扩增SARS囊膜蛋白SPIKE的一段序列，将其克隆到表达载体上。诱导表达后，使用GlutathioneSepharose 4B系统纯化得到多肽样品。化学合成可选用本
人工合成多肽的常规操作方法。经药效学实验测试，本专利技术的多肽类药物对于SARS冠状病毒活病毒感染其易感细胞VeroE6具有阻断能力，表明本专利技术的多肽类药物可抑制SARS冠状病毒侵染宿主细胞。具体实施例方式本专利技术SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.21所示的21个氨基酸序列所示的多肽中，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15采用原核表达系统得到，SEQ ID NO.16～21为人工合成得到。实施例1大肠杆菌表达多肽1.SARS病毒样本的总RNA的提取(1)用1ml trizol(GIBCO)抽提含有SARS病毒样本；(2)加200μl氯仿，剧烈振荡15秒；(3)室温静置3-5min，10000g4℃离心15min； (4)吸出500μl水相，转移到新管中；(5)加入500μl异丙醇，充分振荡混匀；室温静置10min(6)10000g4℃离心10min，得到SARS病毒RNA沉淀。2.SARS病毒SPIKE蛋白基因的克隆(1)将SARS病毒RNA基因组反转录为DNA反转录引物SPIKE蛋白antisense primer反转录酶MMLV-RT(promega)(2)通过PCR方法扩增出SPIKE的DNA序列。扩增引物Sense5’-cgggatccaacgaacatgtttattttcttattatttc-3’antisense5’-cggaattcgtttatgtgtaatgtaatttgacaccc-3’(3)将PCR产物连接到pcDNA3.1+载体中连接方式BamHI，EcoRI双切连接。3.克隆得到下列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15的多肽的序列及其PCR引物如下SEQ ID NO.1NGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTAAATGGCATTGGAGTTACCTGC AGT TGA TGT TGT TGT AAGSEQ ID NO.2PDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQCCAGATGTTGATCTTGGCTTGAAGGTCAATGAGTGATTCSEQ ID NO.3GDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQGGCGACATTTCAGGCATTAACTTGAAGGTCAATGAGTGATTCSEQ ID NO.4ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTT CAG GCA TTA ACG CTT C CCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.5INASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWATTAACGCTTCTGTCGTCAACCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.6VVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWG TCG TCA ACA TTC AAA AAGCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.7IQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTC AAA AAG AAA TTG ACC GCCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.8IDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWA TTG ACC GCC TCA ATG AGG TCCCAAGGCCATTTAATATATTGCSEQ ID NO.9ISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKA TTT CAG GCA TTA ACG CTT CTTTTCCCAATTCTTGAAGSEQ ID NO.10INASVVNIQKEIDRLNEVAK本文档来自技高网...

【技术保护点】
抑制ＳＡＲＳ冠状病毒侵染宿主细胞的多肽类药物，具有如下通式：Ｘ－ＳＥＱ－Ｚ式中，ＳＥＱ表示ＳＡＲＳ冠状病毒囊膜蛋白ＳＰＩＫＥ中的多肽，所述多肽包括如ＳＥＱＩＤＮＯ．１～ＳＥＱＩＤＮＯ．２１所示的２１个氨基酸序 列；Ｘ包括氨基、乙酰基及疏水基团和大分子载体基团；Ｚ包括羧基、氨基及疏水基团和大分子载体基团。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓宏魁，丁明孝，袁克湖，庆婷婷，陈坚，熊梓锴，聂玉春，王在，易凌，江鹏飞，任立晨，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]