通过抑制TAP活性增强MHCⅠ类分子对外来表位的展示的方法技术

增强ＭＨＣ　　Ｉ类分子上的外来表位展示的方法，其中所述方法包括下述步骤：　　　　（ａ）抑制细胞中的ＴＡＰ活性；和　　　　（ｂ）在所述细胞中表达与表位融合的ＭＨＣ　　Ｉ类重链或与表位融合的β２ｍ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过抑制TAP活性增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法。
技术介绍
MHC(主要组织相容性复合体)I类分子是由重链(HC)和β2-微球蛋白(β2m)组成的异二聚体，它几乎存在于每一种细胞的细胞膜表面。MHC I类分子含有由重链形成的沟，沟中可装载10个氨基酸左右的肽。所得MHC I类/肽复合物由在细胞免疫中起作用的细胞毒T淋巴细胞(CTL)上的T细胞受体(TCR)识别。因此，将MHC I类分子上展示的肽称为“表位”(抗原决定簇)。糙面内质网表面存在的、被称作TAP(与抗原加工有关的转运蛋白)的转运蛋白将得自胞质中产生的自身抗原、病毒抗原和肿瘤抗原的肽片段运送至糙面内质网。在此它们与MHC I类重链和β2m形成稳定的MHC I类/肽复合物。β2-微球蛋白分子所起的作用是维持MHC I类分子三维结构的稳定性，并将重链运送至细胞表面(Tasuku Honjo and Takeshi Watanabe(ed.)，“Immune SystemRecognition，differentiation，and proliferation”，The MolecularBiology Society of Japan(ed.)，Maruzen Co.，Ltd.，Tokyop117-118)。已知未与肽结合的空MHC I类分子在37℃的培养条件下非常不稳定。表位，即MHC I类分子上展示的肽是很重要的分子，它可引发针对某种抗原的特异性细胞免疫力。表位是开发肽疫苗所必不可少的组分，所述肽疫苗可用作抗病毒(如HIV)感染或抗癌症的免疫治疗剂。然而，得自很多种病毒抗原和肿瘤抗原的主要表位的肽与MHC I类分子的结合活性较弱。因此，一般说来，当将这些肽单独用作疫苗时，由于它们的稳定性较低，预期不会有什么效果。迄今为止，已将人工表位有效用于黑素瘤患者的临床研究，所述表位具有氨基酸取代，籍此增强与MHC I类分子的结合能力却不会失去其抗原性。然而，鉴定和开发这种稳定性和抗原性皆有所改良的表位却是棘手和困难的，不会总能得到想要的表位。另一方面，人们发现β2m可以增强MHC I类分子上肽的稳定性，基于此发现，开发出使用β2m的佐剂作用的系统。最近，人们尝试表达MHC I类/肽复合物，其中表位肽与MHC I类分子和MHC II类分子或β2m融合(Uger，R.A.and Barber，B.H.，J.Immunol.1601598-1605(1998)；White，J.et al.，J.Immunol.1622671-2676(1999)；Kang，X.et al.，Cancer Res.57202-205(1997)；Uger，R.A.et al.，J.Immunol.1626024-6028(1999)；美国专利号5,869,270)。据报道，与单独使用的肽，特别是那些使用与MHC I类分子的结合活性较弱的表位构建出的肽相比，通过使用接头使表位肽序列与β2m的N-末端融合(与表位相连的β2m；e/β2m)，这些复合物表现出增强的稳定性和CTL识别。目前，通过在大肠杆菌中分开表达和纯化重链(HC)和β2m蛋白，接着在体外使这些分子与合成肽一起折迭，即可制备出含有人MHC I类分子的MHC I类/肽复合物。与之形成对照的是，关于小鼠MHC I类分子，有人报道过使用杆状病毒载体构建出得自昆虫细胞的MHC I类/肽复合物(White，J.et al.，J.Immunol.1622671-2676(1999))。在此系统中，在用杆状病毒共感染的细胞中构建出MHC I类/肽复合物，所述病毒分别表达MHC I类的重链和与表位相连的β2m。由于杆状病毒载体系统表达位于昆虫细胞(例如Sf9细胞)有效启动子下游的外源基因，因此难以将该系统应用于哺乳动物细胞(国际公开号Hei 6-502990的已公开日语译文)。另外，尽管Punnonen等人已公开用于DNA改组的基因疫苗载体(Punnonen，J.et al.，Genetic VaccineVector Engineering，美国专利申请流水号20010006950)，但与表位融合的MHC I类重链或β2m仍未被述及。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供通过抑制TAP活性增强MHC I类分子上的外来表位展示的方法。本专利技术人利用重组DNA技术构建出编码与表位相连的β2m的基因，以使用感染哺乳动物细胞的病毒载体，在哺乳动物细胞中表达与表位相连的β2m分子，并开发出在这些细胞中产生MHC I类/肽复合物的系统。然而，由于哺乳动物细胞表面有很多种MHC I类分子，各个MHC I类分子展示不同种得自细胞内存在的蛋白质的肽，因此，当在哺乳动物细胞中表达与表位相连的β2m时，同与表位相连的β2m形成复合物所必需的MHC I类分子的可利用水平会随着肽水平的降低而降低。本专利技术人认为增加能展示所需表位的MHC I类分子的出现频率对于诱导免疫力非常重要。例如，为了使用MHC I类/肽复合物量化抗原-特异性CTL的频率，已开发出利用“MHC I类/肽四聚体复合物(四聚体)”的方法(Altman J.D.et al.，Science 27494-96(1996))。通过使用生物素-亲和素结合系统使单体MHC I类/肽复合物四聚体化，接着加入荧光标记，制备出所述四聚体，并将其用于FACS分析。由于该方法可以直接分析分离自个体的外周血单核细胞样品，因此该方法不仅简单，能直接反映出每个个体中的频率，还具有高敏感性和高特异性(Wilson，J.D.K.et al.，J.Exp.Med.188785-790(1998)；Kuroda，M.J.et al.，J.Exp.Med.1871373-1381(1998))。本专利技术人注意到下述细节在分析上述MHC I类/肽复合物时，尽管因比例为1∶1的单体MHC I类/肽复合物与TCR的结合较弱，使原先尝试的FACS分析未能成功，但单体MHC I类/肽复合物的四聚体化，即MHC I类/肽复合物与TCR多重结合的同时存在，使得首次分析该复合物成为可能。另外，在上述的哺乳动物细胞中的与表位相连的β2m表达系统中，当展示多种得自细胞内蛋白质的肽时，附近出现展示所需表位的MHC I类/肽复合物的可能性也许会降低。考虑到上述两点，本专利技术人推测如果位于细胞膜表面的MHC I类/肽复合物上能有效展示一种表位，所述表位也能被TCR有效识别，即CTL可以被有效激活。例如，迄今为止，据报道通过在预先用酸处理的细胞表面添加高浓度的单个合成肽，然后洗涤以除去MHC I类/肽复合物上展示的肽，即可有效激活CTL(Langlade-Demoyen，P. et al.，Int.Immunol.61759-1766(1994))。然而，尽管该操作实际上可以在体外进行，但不可能在体内进行。另外，难以将所述操作用于免疫疗法，当考虑到如上文所述，肽的稳定性较低时，更是如此。因此，本专利技术人想通过使用能抑制TAP-介导的肽转运的分子来抑制源自细胞的抗原呈递，从而仅呈递与β2m融合的所需表位以用作抗原。首先构建重组仙台病毒(SeV)载体，该载体表达得自I型单纯疱疹病毒(HSV-1)的ICP47(Hill，A.et al本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：岩本爱吉，立川爱，
申请(专利权)人：株式会社载体研究所，
类型：发明
国别省市：