抑制SARS病毒感染的小RNA分子制造技术

本发明专利技术公开了一组抑制ＳＡＲＳ病毒感染的小ＲＮＡ分子及其作用靶标。这些小ＲＮＡ分子为单链或双链ＲＮＡ分子。本发明专利技术的ＲＮＡ分子能够特异抑制ＳＡＲＳ病毒及与ＳＡＲＳ病毒基因序列相似的其他ＲＮＡ病毒感染。本发明专利技术作药物用靶点可用于筛选ＳＡＲＳ病毒感染防治药物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一组能够特异抑制SARS病毒及与SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的小核糖核酸(RNA)分子及其作用靶点。本专利技术还涉及这些小RNA分子及其作用靶点在医药领域中的应用。RNA干扰(RNA interference RNAi)是生物中双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱导产生的特异性基因沉默(gene silencing)。RNAi研究被“Science”杂志评为2001年十大科技成就之一。自从1995年发现了RNAi现象后，已在多物种中观察到RNAi现象，包括线虫、果蝇、植物、真菌、哺乳动物等。作为一种新的“基因阻滞”技术，RNAi在基因功能的研究中已成为热点。RNAi的高效、特异、可扩散、可调控特性，使其作为成熟的基因筛选技术大规模应用于后基因组的研究中，包括对具有相关功能的基因筛选，某一特异基因的功能鉴定等(Andrew F.et al.1998 Nature 391806-810；ZamorePD.et al.2000 Cell 101(1)25-33；.Hammond SM.et al.2000 Nature404(6775)293-296；Bernstein E.et al.2001 Nature 409(6818)363-366；ElbashirSM.et al.20001 Nature 411(6836)494-498)。SARS冠状病毒在种属分类上属于“ssRNA positive-strand viruses”家系的“Nidovirales”族中的“Coronaviridae”系。它是冠状病毒家族中新出现的一个子类。全长29,736bp，已知有11个编码序列(cds)，而其中的一个cds(putativeorflab polyprotein)与鼠类的肝炎病毒(murine hepatitis virus)结构类似，依据鼠类的肝炎病毒的结构模式，推断出该段cds应该编码了14个蛋白质。SARS冠状病毒是一种高变异性的单链(+)RNA病毒。通过长期对冠状病毒的研究发现于单链(+)RNA病毒在宿主细胞内的复制过程主要包括如下的步骤1)正链RNA利用宿主细胞的翻译系统表达了RNA聚合酶；2)在RNA聚合酶作用下以正链RNA为模板合成了负链RNA；3)负链RNA又作为模板通过“嵌入式”的方式合成了大小不等的编码不同病毒蛋白mRNA和正链RNA；4)病毒在细胞内组装；由此可见SARS病毒其自身携带的正链RNA和在细胞内合成的负链RNA是病毒在细胞内复制的关键。如果破坏病毒的RNA，将直接干扰病毒的复制，而利用RNAi技术筛选获得的小分子双链干扰RNA(siRNA)即可以达到这样效果。这方面类似的抗病毒研究已有成功报道在2003年3月，PNAS杂志连续报道了RNAi在病毒治疗方面的突破性进展。研究发现，在细胞模型上和在含有胚胎的鸡蛋模型上，利用RNAi技术靶向沉默流感病毒的mRNA，可以直接降低病毒mRNA在宿主细胞内的转录，从而有效的降低病毒的复制(Ge Q，et al.2003 PNAS 100(5)2718-2723)。同时还有文献表明，利用RNAi技术可以有效的保护小鼠爆发性肝炎的发生和发展，在爆发性肝炎感染的动物模型上，通过在尾静脉注射siRNA对Fas基因沉默可以有效的降低动物的死亡率(Song E，et al.2003 Nature Med.9(3)347-351)。另外，在抗HIV感染方面也取得类似进展。由于SARS病毒和流感病毒都属于冠状病毒的家族，都是正链RNA病毒。二者在细胞内的复制应该十分相似，因此，我们认为利用RNAi技术来沉默SARS病毒RNA和其编码蛋白mRNA，采用多靶点沉默的原则，将会阻止SARS病毒在宿主细胞内的复制，从而降低其对宿主的损伤作用。本专利技术的上述序列可以通过体外直接化学合成或其他任何方法制备的，也可以通过体外转录得到的，还可以利用载体或其DNA模板在细胞内转录产生的。为阐明本专利技术的小RNA分子的作用靶点，本专利技术的专利技术人通过计算机生物信息学分析获得非常特异的针对SARS病毒复制的药物基因靶点。与本专利技术的上述序列完全一致的基因序列可以作为药物靶点，这些基因序列如下aaGTCTAAACGAACATGAAAC，来源于SRAS病毒mRNA转录起始部位基因序列；aaGTATAAATTTGTCCGTATC，来源于SRAS蛋白中表达NSP2蛋白的部分基因序列；aaGTGAATTCAACACTAGAAC，来源于SRAS蛋白中表达NSP10蛋白的部分基因序列；aaGAACACTTGTGATGGTAAC，来源于SRAS蛋白中表达NSP5蛋白的部分基因序列；aaGTGCTGCTATGACCATGTC，来源于SRAS蛋白中表达NSP10蛋白的部分基因序列； aaGACTGCTCTTAAGAATGC，来源于SRAS蛋白中表达NSP1蛋白的部分基因序列；aaGCTGCAAGACGTTGTTAAC，来源于SRAS蛋白中表达spike蛋白的部分基因序列；aaGGAGCAGCTGCAACTACTC，来源于SRAS蛋白中表达MHV蛋白的部分基因序列；这些靶标可以用于与SARS病毒序列类似的其他RNA病毒感染的预防和治疗。它们的模拟空间结构可以是通过计算机分析或其他分子生物学方法如各种生物文库展示技术等方法获得的。这些模拟空间结构可以作为研制针对SARS或与SARS病毒序列相似的其他RNA病毒感染的药物靶标。实验证明，本专利技术的小RAN分子对SARS病毒感染具有很好的抑制作用，这些分子可以单独或以任何比例、任何组合方式与其他任何治疗SARS病毒感染的方法混合用于SARS病毒感染的预防和治疗，对与SARS病毒序列类似的其他RNA病毒感染的预防和治疗也具有重要的应用价值。本专利技术获得的序列及靶点对SARS病毒的诊断也有一定意义，并具有潜在的应用价值。1.实验方法1.1 siRNA DNA模板设计利用软件和实验经验，根据GENEBANK报告的SARS病毒(病毒株SARS coronavirus CUHK-W1)的基因序列，已经设计并制备了16条siRNA，所靶向的基因几乎涵盖了整个病毒基因组包括MHV(777-2693) NSP1(2694-9959) NSP2(9960-10877) NSP5(11917-12590)rdrp(13347-16141)nsp10(16142-17944)Spikeprotein(21467-25234)以及SARS病毒蛋白转录起始序列，并设计合成能够体外转录成siRNA的DNA模板引物序列，具体序列见表1，单链DNA模板由上海博润生物技术公司合成。上述siRNA序列在目前已报道的所有SARS病毒基因序列中皆存在，且序列完全一致。因此实验设计是针对所有SARS病毒株基因序列皆有效。表1.siRNA DNA模板的引物序列 1.2 DNA模板退火将相互匹配的正义和反义单链DNA模板溶于20μl转录缓冲液中95℃加热10分钟，然后室温放置15分钟。1.3体外转录制备单链RNA按下列转录体系进行体外转录5xbuffer 4μlrNTP(25mM each) 4本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有下述序列结构的任意一个双链ＲＮＡ分子，即序列表中的： 序列１和２ ５’ＧＧＡＧＣＡＧＣＵＧＣＡＡＣＵＡＣＵＣＡＵ３’ ５’ＧＡＧＵＡＧＵＵＧＣＡＧＣＵＧＣＵＣＣＵＵ３’ 序列３和４ ５’ＧＡＣＵＧＣＵＣＵＵＡＡＧＡＡＡＵＧＣＡＡ３’ ５’ＧＣＡＵＵＵＣＵＵＡＡＧＡＧＣＡＧＵＣＵＵ３’ 序列５和６ ５’ＧＡＡＣＡＣＵＵＧＵＧＡＵＧＧＵＡＡＣＡＣ３’ ５’ＧＵＵＡＣＣＡＵＣＡＣＡＡＧＵＧＵＵＣＵＵ３’ 序列７和８ ５’ＧＵＡＵＡＡＡＵＵＵＧＵＣＣＧＵＡＵＣＣＡ３’ ５’ＧＡＵＡＣＧＧＡＣＡＡＡＵＵＵＡＵＡＣＵＵ３’ 序列９和１０ ５’ＧＵＧＣＵＧＣＵＡＵＧＡＣＣＡＵＧＵＣＡＵ３’ ５’ＧＡＣＡＵＧＧＵＣＡＵＡＧＣＡＧＣＡＣＵＵ３’ 序列１１和１２ ５’ＧＵＵＵＣＡＵＧＵＵＣＧＵＵＵＡＧＡＣＵＵ３’ ５’ＧＵＣＵＡＡＡＣＧＡＡＣＡＵＧＡＡＡＣＵＵ３’ 序列１３和１４ ５’ＧＣＵＧＣＡＡＧＡＣＧＵＵＧＵＵＡＡＣＣＡ３’ ５’ＧＵＵＡＡＣＡＡＣＧＵＣＵＵＧＣＡＧＣＵＵ３’，或 序列１５和１６ ５’ＧＵＧＡＡＵＵＣＡＡＣＡＣＵＡＧＡＡＣＡＧ３’ ５’ＧＵＵＣＵＡＧＵＧＵＵＧＡＡＵＵＣＡＣＵＵ３’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邵宁生，杨光，李洁，曹国军，刘雪梅，范明，柳川，沈倍奋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]