从克隆的核苷酸序列制备减毒负链RNA病毒疫苗制造技术

适于疫苗使用的减毒重组负链ＲＮＡ病毒产生自一个或多个编码该病毒的多聚核苷酸分子。该主题病毒的一个重组基因组或反基因组被修饰，以编码该病毒重组蛋白在一个或多个相应于异源突变负链ＲＮＡ病毒减毒突变位点的氨基酸位点上的突变。在异源负链ＲＮＡ病毒中所鉴别的一个相似的减毒突变由此发生于重组病毒的一个相应位点上，以赋予该重组病毒减毒的表现型。在该重组病毒中发生的减毒突变与在异源突变病毒中鉴别的减毒突变相比可以是同一性或保守性的。通过以这种方式将该突变引入重组负链ＲＮＡ病毒，候选疫苗病毒被改造，以在易感寄主中诱发预期的抗主题病毒的免疫反应。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
负链RNA病毒包含有不同目的重要且高破坏性的病原体单负链病毒(Mononegavirales)。这个组中的人类病原体包括狂犬病病毒(RaV)、麻疹病毒(MeV)、腮腺炎病毒(MuV)、呼吸道合胞病毒(RSV)及数个基因型的副流感病毒(PIV)。以RSV为例，因为其在一岁以内的婴儿中导致肺炎及支气管炎疾病，该病原体危害位于其他所有微生物病原体之上。在因呼吸道疾病而入院治疗的儿童中，由RSV引起的占1/5以上，RSV在美国一年内导致估计有91,000名患者住院及4,500名死亡。人类PIV病毒(例如，HPIV1、HPW2及HPIV3)在人群中也导致很严重的疾病，其可导致支气管炎、哮喉及肺炎，尤其是在婴幼儿中。Karron等，J.Infect.Dis.1721445-50(1995)；Collins等，″副流感病毒″(Parainfluenza Viruses)，p.1205-1243。在B.N.Fields等编辑的Fields Virology，第三版，第一卷，Lippincott-Raven出版社，费城(1996)；Murphy等，病毒研究(Virus Res.)，111-15(1988)。人类PIV病毒所致感染在婴幼儿呼吸道感染而住院的群体中占据接近20％。尽管经过数十年的研究也研制出几种有效疫苗以对抗RSV及PIV，但是还没有获得既安全又有效的疫苗以降低严重RSV感染的发病率和死亡率。同样需要研制出有效的疫苗或改良疫苗来对抗另一些重要的单负链病毒。阻碍抗负链RNA病毒的活疫苗发展的障碍是在减毒及免疫原性之间取得平衡的困难性。减毒病毒的遗传稳定性同样是一个问题。在RSV疫苗的发展过程中也遇到RSV在细胞培养中生长性较差及病毒颗粒不稳定性等困难。RSV感染的另一特征是诱导产生的免疫性并不完全保护随后产生的感染。产生这种情况的原因很多，包括免疫系统在呼吸道的腔表面限制病毒感染方面相对低效，局部粘膜免疫的短期性，快速及广泛的病毒复制，婴幼儿中由于免疫系统不成熟所致减毒的免疫反应，由于母亲血清抗体经胎盘传输所致的免疫抑制，以及病毒的某些特征如G蛋白的高度糖基化。同样正如下面所讨论的那样，RSV以两个抗原亚型A及B的形式存在，对抗其中之一的免疫性对另一个亚型效力较低。在二十世纪60年代中叶，甲醛灭活的病毒疫苗作为抗RSV的疫苗被测试，但在抗RSV感染或疾病的保护上没有获得成功，且事实上随后的病毒感染呈现恶化的症状。(Kim等，Am.J.Epidemiol.，89422-434(1969)，Chin等，Am.J.Epidemiol.，89449-463(1969)；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.，89405-421(1969))。最近，RSV疫苗的开发已聚焦于减毒RSV突变株上。Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204690-694(1968)报道了RSV的一种冷传代突变株(cpRSV)，其被充分减毒成为候选疫苗。此突变株与野生型(wt)亲代病毒相比，显示出轻微增加的在26℃生长的能力，但其复制既没有温度敏感性也没有明显的冷适应性。然而，却将冷传代突变株减毒用于成年人。尽管对于已被RSV感染的婴幼儿(例如，血清反应阳性的个体)，cpRSV已令人满意地被减毒并且具有免疫原性，但cpRSV仍保留对于血清反应阴性婴儿上呼吸道的低水平毒性。类似的，Gharpure等人，病毒学杂志(J.Virol.)3414-421(1969)报道了作为有价值的候选疫苗的温度敏感性RSV(tsRSV)突变株。一种突变株ts-1，被广泛地用于实验室和自愿受试者中。突变体在成年自愿者中产生无症状感染且在致免疫45天后对野生型病毒攻击产生抗性。对比血清反应呈阳性的婴儿和遭受无症状感染的儿童，血清反应呈阴性的婴儿呈现鼻炎征兆和其它轻微的症状。此外，ts表型的稳定性被检测到，尽管表现出部分或全部温度敏感性缺失的病毒占可从疫苗重新获得的病毒的较小比例，且不与除轻微鼻炎疾病以外的疾病征兆相关联。这些和其它的研究显示特定的冷传代和温度敏感性RSV株被不充分减毒且在疫苗接种者导致轻微的疾病特征，尤其血清反应阴性的婴儿，而其它的被超减毒且不能充分的复制来引起保护性的免疫应答，(Wright等，Infect.Immun.，37397-400(1982))。此外，候选疫苗突变株的遗传不稳定性导致其温度敏感性表型的缺失，进一步阻碍了有效的RSV疫苗的开发。通常参见，Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1451158-1164(1974)，McIntosh等，Pediatr.Res.8689-696(1974)，以及Belshe等，J.Med.Virol.，3101-110(1978)。抛弃了通过不确定的生物学方法例如冷传代构建合适减毒RSV株的方法，研究者通过纯化的RSV包膜糖蛋白来测试亚型疫苗候选毒株。糖蛋白在棉鼠的肺中诱导对RSV感染的抗性，Walsh等，J.Infect.Dis.1551198-1204(1987)，但是抗体具有非常弱的中和活性，且用纯化的亚型疫苗免疫啮齿动物会导致疾病的加强，这使人联想到先前已处理过的RSV疫苗(Murphy等，Vaccine 8497-502(1990))。表达F或G包膜糖蛋白的基于疫苗病毒重组体的疫苗已被进行研究。这些重组体表达不能被从真正病毒对应物中区别开的RSV糖蛋白，用疫苗-RSV F和G重组体经皮感染的啮齿动物表现出高水平的中和病毒感染力的特异性抗体。事实上，棉鼠用疫苗F重组体感染可刺激出对RSV在下呼吸道复制的几乎完全的抗性以及在上呼吸道中的明显的抗性。Olmsted等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)837462-7466(1986)。然而，用疫苗F和G重组体免疫黑猩猩，在上呼吸道中几乎没有提供抗RSV攻击的保护(Collins等，Vaccine8164-168(1990))，其在下呼吸道中提供的保护前后不一(Crowe等，疫苗(Vaccine)111395-1404(1993))。针对RSV和其它负链RNA病毒的生物减毒疫苗株、亚型疫苗以及其它疫苗开发策略的不成功使得迫切需要一种新的方法来开发新的疫苗，特别是人工重组候选疫苗的方法来加入遗传变化，以生产具有新表型特性的活减毒RSV重组体。然而，对RSV和其它反义RNA病毒的基因组RNA的操纵处理至今仍是很难的。此方面的主要障碍包括这些病毒的裸露的基因组RNA的非感染性、病毒在组织培养物中的不良生长、冗长的复制循环、病毒体的不稳定性、染色体组复杂以及基因产物结构的难以控制。以PIV3为例，两个活减毒候选疫苗已经得到了特别的关注，这其中一个候选疫苗是牛PIV3(BPIV3)株其与HPIV3在抗原性上相关，且其已显示保护动物抵抗HPIV3。BPIV3是减毒的，遗传稳定的，且在人类婴幼儿中是具有免疫原性的(Karron等，J.Inf.Dis.1711107-14(1995a)；Karron等，J.Inf.Dis.1721445-1450，(1995b)).另一个PIV3候选疫苗JS cp45，是HPIV3的JS野生型(wt)株的冷适应性突变株本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从一个或多个编码经分离的减毒重组负链ＲＮＡ病毒的经分离的多核苷酸分子生产所述负链ＲＮＡ病毒的方法，其包括：在一个细胞或无细胞体系中共表达一个或多个表达载体，其含有一个或多个编码重组基因组或反基因组及产生所述重组负链ＲＮＡ病毒的感染性病毒颗粒所必需的基本病毒蛋白的多核苷酸分子，所述重组基因组或反基因组被修饰，以编码在所述重组病毒的重组蛋白中相应于在一个异源突变负链ＲＮＡ病毒中所鉴别的减毒突变的氨基酸位置的氨基酸位置上的突变，其通过在所述重组蛋白中引入而赋予所述重组病毒减毒表型。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：布赖恩R墨菲，彼得L柯林斯，安娜P德宾，马里奥H斯基亚道普洛斯，
申请(专利权)人：美国政府健康及人类服务部，
类型：发明
国别省市：US[美国]