本发明专利技术公开了一种高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞的制备方法。属于体外细胞培养领域。方法包括：采集并分离患者外周血单个核细胞，先经Mini?MACS分选得到γδT阳性细胞，再经磷酸抗原HDMAPP(3μM)激活，同时加入基因重组人细胞因子IL-2(100IU/ml)和IL-21(10ng/ml)，置于37℃，5％CO2的培养箱中孵育，4天后补充含有IL-2的培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞。本发明专利技术利用免疫磁珠分选技术以获得高纯度的γδTCR阳性细胞，然后联用IL-2和IL-21共同刺激培养的γδT细胞，使其抗肿瘤功能增强；解决了现有技术体外扩增的γδT细胞纯度低及细胞毒活性低的问题。
Method for preparing high purity and high cytotoxic activity gamma delta T cell
The invention discloses a method for preparing high purity, high cytotoxic activity gamma delta T cell. The invention belongs to the field of in vitro cell culture. The method comprises: collecting and separating the patients with peripheral blood mononuclear cells by Mini? MACS from gamma delta T cells, and then by phosphoantigen HDMAPP (3 M) activation, while adding recombinant human cytokines IL-2 (100IU/ml) and IL-21 (10ng/ml), at 37 DEG C, incubator 5%CO2 after 4 days of incubation in culture medium containing IL-2 cultured for 7-14 days, can obtain high purity and high cytotoxic activity of gamma delta T cells. The present invention using immunomagnetic separation technique to obtain gamma delta TCR positive cells of high purity, and the combination of IL-2 and IL-21 co cultured gamma delta T cells, the antitumor function enhancement; solves the question of gamma delta T cells in vitro amplification of existing technology of low purity and low cytotoxic activity.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外细胞培养领域，具体是一种高纯度、高细胞毒活性的Y δτ细胞的制备方法。
技术介绍
γ δ T细胞是介于获得性免疫和天然免疫之间的特殊免疫类型细胞，具有抗原特异性识别功能而无MHC限制性。目前用于抗肿瘤研究的Y δΤ细胞主要是指VY9VS2T细胞，约占外周血Y δ T细胞的50-95%。人外周血的V γ 9V δ 2Τ细胞通过细胞表面TCR识别非肽类磷酸化抗原，在抗原识别过程中无需MHC分子的限制和提呈。目前常用于活化V γ 9V δ 2Τ细胞的非肽类磷酸化抗原有异戊二烯焦磷酸(IPP)、含氮双磷酸盐(N-BPs)及烷基胺。其中IPP是甲羟戊酸通路的中间产物，能直接引起V γ 9V δ 2Τ细胞的活化。N-BI^s及烷基胺是通过抑制甲羟戊酸通路的限速酶一法尼基二磷酸合酶，使胞内IPP蓄积，从而间接活化Vy 9V δ 2Τ细胞。由于 IPP在肿瘤细胞内广泛存在，使V γ 9V δ 2Τ细胞对IPP刺激适应，并呈弱反应或无反应。故使用更为有效的磷酸抗原是目前需要解决的技术难题之一。最新研究表明，2-甲基-赤藻糖醇-4-磷酸途径的产物羟甲异戊烯二磷酸酯 (HMBPP)是目前功能最强的V γ 9V δ 2Τ细胞激活剂，其刺激V γ 9V δ 2Τ细胞增殖能力是IPP 的10000倍，法国hnate Wiarma公司所合成的磷酸化抗原HDMAPP (商品名Picostim)的结构式与HMBPP基本相同，经体外实验证实同样具有强大的刺激V γ 9V δ 2T细胞的功能。磷酸化抗原与IL-2联用可在体外选择性扩增V γ 9V δ 2Τ细胞，并在临床试验中得到了证实。利用这一方法体外扩增肝癌、结直肠癌、血液肿瘤患者的自体VY9VS δ2Τ细胞技术已经建立。这些V γ 9V δ 2Τ细胞大多数为⑶27XD45RA+表型，表达穿孔素、颗粒酶A和 B和分泌IFN- γ，并且呈现多细胞克隆的多样性。目前已开展V γ 9V δ 2Τ细胞治疗晚期肿瘤的I期临床研究，Bennouna等人对10 例晚期肾癌研究发现60% (6/10)的患者疾病稳定，稳定时间达25. 7周。Dieli等人利用 VY9V52T细胞激动剂和IL-2治疗18例激素抵抗性前列腺癌，结果有3例部分缓解，5例稳定。尽管V γ 9V δ 2Τ细胞治疗在可行性、治疗耐受以及初步的疗效方面取得了令人鼓舞的结果，但是该疗法尚未取得最佳疗效，其主要原因在于V γ 9V δ 2Τ细胞的体内杀伤肿瘤活性还有待提高。因此，寻求增强V γ 9V δ 2Τ细胞的抗肿瘤细胞毒活性的新手段十分必要。IL-21是一个良好的细胞因子，IL-21R广泛表达于包括活化的、δ T细胞在内的淋巴细胞表面。IL-21与IL-2、IL-15等细胞因子联用可协同刺激原始和记忆性⑶8+T细胞及NKT细胞增殖，IL-21同样可以刺激Y δ T细胞的短期增殖，并且通过上调穿孔素和颗粒酶来增强NK和⑶8+Τ细胞的抗肿瘤功能，因此我们选择IL-21来刺激V γ 9V δ 2Τ细胞。本项专利技术证实IL-21在一定程度上能促进磷酸化抗原活化的V γ 9V δ 2Τ细胞的分裂，短暂诱导V Y 9V δ 2Τ细胞增殖。IL-21与IL-2共同刺激的V γ 9V δ 2Τ细胞抗肿瘤功能显著增强， 表现为⑶56及一些溶酶体颗粒表达增加。由于V γ 9V δ 2Τ细胞在人外周血中含量极微，单用磷酸抗原HDMAPP刺激扩增两周获得的细胞纯度仍低于70%，无法为临床提供一种高纯度的细胞制剂，因此我们专利技术一种先用免疫磁珠分选技术富集V γ 9V δ 2T细胞，然后用HDMAPP联合IL-2和IL-21扩增高纯度VY9VS2T细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种高纯度、高细胞毒活性的Y δ T细胞的制备方法，能提高Y δ T细胞纯度，及CD56+、穿孔素、颗粒酶表达率。克服现有制备Y δ T细胞的方法存在纯度低、细胞毒活性低的技术问题。本专利技术所采用的技术方案是一种制备Vy 9V δ 2Τ细胞的方法，包括如下步骤采集并分离患者外周血单个核细胞，先经Mini MACS分选得到γ δ T细胞，再经HDMAPP激活， 同时加入IL-2和IL-21，置于37°C，5% CO2的培养箱中孵育，4天后补充含有IL-2的培养基继续培养7-14天，即可得到高纯度、高细胞毒活性的V γ 9V δ 2T细胞。根据本专利技术，所述的培养基为GT-551人淋巴细胞培养基或RPMI1640，并添加10% 自身血浆。所述的单个核细胞是采用Ficoll密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水清洗，低速离心后获得。所述的Y S T细胞是指Vy 9V δ 2Τ细胞，采用Mini MACS间接免疫磁珠正向分选方法获得。所述的HDMAPP的终浓度为3 μ M，细胞因子IL-2的终浓度为100IU/ ml，IL-21的终浓度为lOng/ml。依据单个核细胞的浓度不同，细胞继续培养时间约7_14天。本专利技术所用的原料和试剂除特别说明外，均市售可得。本专利技术的有益效果是利用免疫磁珠分选技术以获得高纯度的Y δ TCR阳性细胞，然后联用IL-2和IL-21共同刺激培养的γ δ T细胞，使其抗肿瘤功能增强。解决了现有技术体外扩增的Y ST细胞纯度低及细胞毒活性低的问题。具体实施例方式下面用实施例来具体说明本专利技术，但本专利技术并不受其限制。下面实施例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。实施例1 γ δ T细胞的制备1)外周血单个核细胞(PBMC)的制备用血细胞分离机采集患者抗凝血，1500rpm/min离心10分钟，吸取上层血浆，56°C 灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释血细胞沉淀，比重为1. 077的人淋巴细胞分离液与稀释血按1 1. 5的比例加入离心管中，2000rpm/min离心15分钟，小心抽取白细胞层，用生理盐水清洗两次，低速离心后得到外周血单个核细胞(PBMC)。2) Mini MACS间接免疫磁珠正向分选Y δ T细胞用含10%(V/V)自身血浆的RPMI1640重悬外周血单个核细胞，并调整细胞浓度至108/ml，加入10 μ 1抗TCR γ / δ Hapten抗体，混勻后4°C孵育1小时，用MACS缓冲液离心洗涤两次；用MACS缓冲液重悬细胞至108/ml，加20 μ 1抗Hapten磁珠后4°C孵育40分钟，离心洗涤后用500 μ 1 MACS缓冲液重悬细胞待分选。将MS柱置于Mini MACS上，用 500 μ IMACS缓冲液冲洗MS柱，将上述制备的500 μ 1细胞悬液加至MS柱中让其自然流过， 用500 μ IMACS缓冲液冲洗柱子三遍，流过MS柱的为Y / δ -Τ细胞。取下MS柱加Iml缓冲液将附壁细胞快速从柱上冲洗下来，收集的即为Y S T细胞。3)高效Y δ T细胞的诱导扩增将上述获得的Y δ T细胞置于含有HDMAPP(3 μ Μ)的RPMI1640培养液中，放入 225cm2的培养瓶中，同时加入细胞因子IL-2(终浓度为100IU/ml)和IL_21(终浓度为 10ng/ml)，置于37°C，5% CO2的培养箱中孵育，每M小时观察细胞形态及生长情况，并计数细胞。每2-3天补充含有IL本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种高纯度、高细胞毒活性的γδＴ细胞的制备方法，其特征在于制备步骤如下：１）采集患者外周血，分离并收集外周血单个核细胞；２）用抗ＴＣＲγ／δ微珠试剂盒Ｍｉｎｉ ＭＡＣＳ分选γδＴ细胞；３）用含１０％自身血浆的培养基重悬上述获得的阳性细胞，经磷酸抗原ＨＤＭＡＰＰ活化后，加入细胞因子ＩＬ－２和ＩＬ－２１培养３天；４）依据细胞生长状况每２－３天补加含ＩＬ－２的新鲜培养基继续培养７－１４天，获得高扩增倍数的γδＴ细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑骏年，李慧中，李连涛，刘俊杰，徐为，陈菲菲，程乾，章龙珍，裴冬生，
申请(专利权)人：郑骏年，
类型：发明
国别省市：32
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