本发明专利技术属于生物与新医药技术领域。公开了一种嵌合抗原受体hFⅦL-CD8-OX40-CD3ζ及其用途。该嵌合抗原受体由人凝血因子Ⅶ轻链（human?factor?VII?light?chain，hFVIIL）、CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。该嵌合抗原受体能用于修饰T细胞，修饰后的T细胞用于肿瘤的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物与新医药
具体说是一种嵌合抗原受体hF vn L-⑶8-0X40-⑶3 ζ的制备及其用他途。其制备涉及利用分子生物学技术将编码人凝血因子VII轻链(human factor VII light chain, hFVIIL)、0)8的跨膜区和胞内区及0X40和CD3 ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体hF YD L-⑶8-0X40-⑶3 ζ的融合基因片段，并在其5’末端插入信号肽Ig κ的编码序列。然后将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒。利用该慢病毒感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。这种T细胞能够识别肿瘤细胞表面的组织因子，用于肿瘤治疗。
技术介绍
嵌合抗原受体是模拟T细胞受体功能的人工受体，由抗原识别结构域(配体或单 链抗体)和T细胞的一系列信号结构域依次连接而成。利用嵌合抗原受体修饰T细胞能够将配体或抗体的特异性识别作用与T细胞的效应功能联合起来，进行肿瘤靶向免疫治疗。此疗法是对人体自身T细胞加以改造后用于治疗，相对于放、化疗，其毒副作用较弱。由于嵌合抗原受体修饰的T细胞通过其抗原识别结构域识别肿瘤细胞表面抗原，然后启动杀伤作用，因此其治疗具有靶向性。由于该种T细胞通过其嵌合抗原受体直接识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过其信号结构域直接将识别信号传递至胞内，激活T细胞的杀伤活性，因此可以绕开常规细胞免疫的主要组织相容复合体(MHC)限制性，从而有效克服肿瘤细胞MHC表达量低造成的免疫逃逸，并可以靶向非蛋白质肿瘤抗原。组织因子(TF)高表达于多种恶性肿瘤细胞(肺癌、乳腺癌、肝癌等)及肿瘤血管内皮细胞，而在正常细胞及正常血管内皮细胞不表达或低表达。因此，TF是肿瘤靶向治疗的潜在位点。凝血因子VII是TF的天然配体，其与TF结合的亲和力(以Kd值表示)可达10_12Μ，而目前报道的抗TF抗体与TF的亲和力仅为10_8-10_9 M0正常生理情况下，活化的凝血因子VII由N端的轻链和C端的重链两部分构成，轻链主要负责受体结合活性，重链主要负责凝血酶活性。因此，人凝血因子VII轻链(human factor W light chain,hF VII L)可以作为针对组织因子的抗肿瘤药物的靶向载体。嵌合抗原受体靶点识别结构域的灵活性及其与T细胞表面的空间距离，对于嵌合抗原受体修饰T细胞的特异杀伤活性至关重要。⑶8是⑶8+ T细胞表面的一个天然Marker，其hinge区是一个柔性区域。因此，其hinge区和跨膜区可以用来连接嵌合抗原受体的靶点识别结构域和胞内信号结构域。⑶3分子通过盐桥与T细胞受体(TCR)相连，其胞内段含有三个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，TCR识别并结合由MHC分子提呈的抗原肽后，导致⑶3的ITAM的酪氨酸残基磷酸化，进而激活T细胞。因此，CD3分子是T细胞活化过程中的重要分子，其胞内结构域是T细胞活化所必需的。0X40是T细胞的共刺激分子，它与T细胞中的受体结合后可以有效阻止T细胞的凋亡，增强细胞因子的生产，对维持T细胞的杀伤活性，提升T细胞的存活能力具有重要作用。因此，在嵌合抗原受体中加入共刺激分子0X40对于增强嵌合抗原受体修饰T细胞的存活能力，增强其肿瘤细胞杀伤活性具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术提供一种嵌合抗原受体hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ ,它是一种融合蛋白。该嵌合抗原受体由人凝血因子VII轻链、⑶8的hinge区和跨膜区及0X40和⑶3 ζ的胞内信号结构域串联构成。该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示。该嵌合抗原受体含有针对人组织因子的人凝血因子VII轻链，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。该嵌合抗原受体以⑶8的hinge区和跨膜区及0X40和⑶3 ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示。该嵌合抗原受体的编码基因能够被转移至T细胞内，用于修饰T细胞；利用该嵌合抗原受体修饰的T细胞，能够通过识别肿瘤细胞表面的组织因子，杀死肿瘤细胞，进行肿瘤治疗。 本专利技术通过基因合成技术合成由编码⑶8的跨膜区和胞内区及0X40和⑶3 ζ胞内信号结构域的核苷酸序列构成的融合基因片段⑶8-0X40-⑶3 ζ。通过巢式PCR在人凝血因子VII轻链的5’端加上Ig κ信号肽编码序列，得到融合基因序列IGK-hFVDL。然后通过重叠延伸PCR技术将融合基因片段IGK-hF YD L和⑶8-0X40-⑶3 ζ拼接成编码嵌合抗原受体 hF VD L-CD8-0X40-CD3 ζ 的融合基因片段，命名为 IGK_hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ。然后将该融合基因片段插入慢病毒表达载体中，包装成携带IGK-hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ编码基因的慢病毒。利用该慢病毒感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。通过LDH细胞毒性分析实验证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞具有特异杀伤作用。因此本专利技术所述的嵌合抗原受体hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ可在肿瘤治疗中应用。附图说明图I是本专利技术所述的在人凝血因子Vn轻链(hF vn L)编码基因的5’端加上Ig K信号肽编码序列的3次巢式PCR扩增电泳图，图中，I泳道DNA分子量标记；2泳道用Pl和P4进行第一次巢式PCR的扩增产物(482 bp) ；3泳道用引物P2和P4进行第二次巢式PCR的扩增产物(509 bp)；4泳道用引物P3和P4进行第三次巢式PCR扩增得到的融合基因片段 IGK-hF VIIL (537 bp)；图2是本专利技术所述编码嵌合抗原受体IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ的融合基因全长序列扩增电泳图，图中，I泳道=DNA分子量标记；2泳道编码IGK-hF YD L的DNA片段(537 bp) ;3泳道编码CD8-0X40-CD3 4的DNA片段(661 bp) ;4泳道编码嵌合抗原受体IGK-hF YD L-CD8-0X40-CD3 ζ 的融合基因片段(1198 bp)。图3是本专利技术所述的慢病毒表达质粒(pLVX-IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ )的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。图4是本专利技术所述慢病毒表达质粒PLVX-IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，I泳道DNA分子量标记；2泳道慢病毒表达质粒 pLVX-IGK-hF YD L-CD8-0X40-CD3 ζ (9390 bp) ;3 泳道用限制性内切酶 EcoR I和Xba I双酶切慢病毒表达质粒pLVX-IGK-hF W L-CD8-0X40-CD3 ζ后所得到的编码IGK-hF YD L-CD8-0X40-CD3 ζ 的 DNA 片段(1198 bp)和载体片段(8192 bp)；图5是流式检测嵌合抗原受体hF W L-⑶8-0X40-⑶3 ζ在T细胞中的表达效率图。图6是Western blot检测人肺癌细胞NCI-H292、人乳腺癌MDA-MB-231、人结肠癌HCT-116、人肺癌A549、人成纤维细胞BJ和人乳腺癌细胞MCF-7中组织因子的表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嵌合抗原受体hFⅦL？CD8？OX40？CD3ζ，其特征在于：该嵌合抗原受体由肽人凝血因子Ⅶ轻链、CD8的hinge区和跨膜区及OX40和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑骏年，张青，裴冬生，杨洁，李连涛，李慧忠，张宝福，方琳，赵铁锁，程乾，章龙珍，
申请(专利权)人：郑骏年，
类型：发明
国别省市：
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