融合串联抗菌肽及其制备方法技术

融合串联抗菌肽及其制备方法，它涉及抗菌肽及其制备方法。本发明专利技术解决了现有抗菌肽合成方法中产量低，生产成本高；特别是采用基因工程重组表达抗菌肽过程中抗菌肽分子容易被酶解，导致表达量低或者很难表达的问题。融合串联抗菌肽由Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin?A(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四种抗菌肽串联而成。制备方法：一、设计cDNA片段；二、构建重组表达载体；三、获得转化子；四、诱导，收集上清液，蛋白纯化。本发明专利技术用于抗菌肽制备领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗菌肽及其制备方法。
技术介绍
抗菌肽是生物体在免疫病原体刺激下，免疫防御系统产生的ー类具有生物学活性的小分子多肽，是动植物非特异免疫系统的重要成分，广泛分布于细菌、真菌、高等植物、昆虫、两栖类、哺乳动物以及人类体内。抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等作用。和抗生素相比，抗菌肽具有分子质量小、抗菌谱广、水溶性好、耐热性强、无免疫原性和作用机制独特等优点，不易引起微生物的耐药性，被认为是一种极具应用潜力的健康安全的抗菌物。 Fowlicidin-2是在鸡体内发现的ー种新型阳离子抗菌肽，由31个氨基酸残基组成，具有广谱的抗菌活性，具有脂多糖(LPS)结合活性及免疫调节功能。与多数抗菌肽不同的是Fowlicidin-2具有很强的盐离子耐受性，抗菌活性不受生理盐浓度的影响，甚至在NaCl浓度为150mmol/L时，仍然保持着抗菌活性，对抗性菌株仍然有很强的抑制作用，这意味着Fowlicidin-2在抗感染治疗应用上有着很大的潜力。天蚕素B(CecropinR)是由Boman从天蚕体内分离得到的杀菌活性多肽，由37个氨基酸残基组成，其N端碱性很强，形成双亲a -螺旋结构，具有广谱的抗菌作用，具有较好的热稳定性，能选择性地杀伤肿瘤细胞，对正常的哺乳动物细胞和昆虫细胞无不良影响。CecropinA(1-8)-Melittin (1-18)是由天蚕素A的1_8位氨基酸残基和蜂毒素的1-18位氨基酸残基组成的杂合分子，氨基端为天蚕素部分，羧基端为蜂毒素部分，此杂合分子具有较2个单独亲本更广的抗菌谱，同时去除了蜂毒素的溶血作用，拓宽了的抗菌谱。除抗菌能力外，还具有杀伤癌变细胞和包被的病毒、促进伤ロ愈合等功能。死亡素(Thanatin),又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺益蜷(Podisus maculiventris)中发现的，是近来发现的抗菌谱最广的抗菌肽之一。由21个氨基酸残基组成，结构简单，对G+、G_和某些真菌都有抑制作用，但是对酵母影响不大，对哺乳动物细胞也不表现出溶血性。抗菌肽的制备主要有生物材料提取法、化学合成法和基因工程表达法三种。由于抗菌肽在生物组织中含量低、分离困难，除少数几种昆虫抗菌肽外，提取法制得的样品难以满足应用需要，仅适用于氨基酸序列分析和初歩的抗菌试验。化学合成法分为液相合成法、固相合成法、片段合成法等等，都需要用到大量的化学制剂，存在成本高、エ艺繁琐的缺陷。采用基因工程的方法重组表达抗菌肽是目前比较理想的抗菌肽生产手段，但是由于抗菌肽分子量太小，在表达过程中的翻译和转录时容易酶解，出现表达量低或者很难表达的问题。而且与传统抗生素相比，抗菌妝的抗菌活性尚待进一步提尚。
技术实现思路
本专利技术要解决现有抗菌肽合成方法中产量低，生产成本高；特别是采用基因工程重组表达抗菌肽过程中抗菌肽分子容易被酶解，导致表达量低或者很难表达的问题，而提出的。融合串联抗菌妝由Fowlicidin-2、天香素 B、CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)和死亡素四种抗菌肽串联而成，Fowlicidin-2、天蚕素B、Cecropin A(1-8)-Melittin(1-18)与死亡素之间用GlySerGly联接。本专利技术融合串联抗菌肽由124个氨基酸组成，根据Fowlicidin-2、天蚕素B、CecropinA(1-8)-Melittin (1-18)与死亡素联接顺序的不同共有24种组合。融合串联抗菌肽按以下步骤制备一、融合串联抗菌肽由四种原始小分子抗菌肽串联而成，四种原始小分子抗菌肽之间用GlySerGly联接，再根据毕赤酵母密码子偏爱性设计融合串联抗菌肽的cDNA片段；然后在融合串联抗菌肽cDNA片段5’端加入Kex2裂解位点的三个密码子，在融合串联抗菌肽cDNA片段3’端加入终止密码子TAA，再在5’和3’端分别引入Xho I和Xbal I粘性末端，连接PUC59，构建了克隆质粒pUC57-TM ；ニ、用Xho I和Xbal I双酶切PUC57-TM，获得融合串联抗菌肽的编码基因片段，与pPICZ a C连接，转化大肠杆菌DH 5 a，PCR和测序进ー步鉴定，构建重组表达载体pPICZa C-TM ；三、将重组表达载体pPICZ a C-TM经Sac I线性化后，电转入毕赤酵母SMD1168中，用100 u g/mL浓度的Zeocin (博莱霉素)和PCR法筛选获得高拷贝的重组酵母转化子；四、将重组酵母转化子的单菌落接种于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)中，在30°C、280r/min的条件下培养16 17h，然后取培养液转接到BMGY培养基中，在30°C、300r/min条件下培养到OD值为2 6，收集菌体转接于BMMY培养基中，在30°C、300r/min、1%甲醇的条件下诱导72h，在诱导过程中每隔24h补加甲醇保持终浓度为0. 5% 1% ;诱导后离心收集上清液，蛋白纯化系统纯化获得融合串联抗菌肽； 步骤一中四种原始小分子抗菌肽为Fowlicidin-2、天蚕素B、CecropinA(I-8)—Melittin(I-18)和死亡素。本专利技术采用毕赤酵母作为表达外源蛋白的宿主菌，毕赤酵母具有营养要求低，易于培养的优点。毕赤酵母存在酵母氧化酶A0X1，为外源基因启动子，受甲醇诱导，严格调控外源蛋白的表达。在表达过程中毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白较少，简化了后期蛋白的分离与纯化。本专利技术利用酵母表达系统成功实现了融合串联抗菌肽的重组制备。本专利技术步骤一中Kex2裂解位点的三个密码子所编码的氨基酸序列为GluLysArg，三个密码子的碱基序列为GAGAAGAGA。本专利技术步骤一中根据毕赤酵母密码子偏爱性设计Fowlicidin-2的基因序列为 CTAGTTCAAAGGGGACGTTTTGGAAGATTTCTGAGAAAGATCCGAAGATTCAGACCAAAGGTTACAATCACTATTCAAGGTAGTGCTCGATTC根据毕赤酵母密码子偏爱性设计天蚕素B的基因序列为AAATGGAAAGITITTAAGAAGATTGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCAIATTATCA ;根据毕赤酵母密码子偏爱性设计 CecropinA(1-8)-Melittin(1-18)的基因序列为 AAATGGAAAGITITTAAGAAGAITGAGAAAATGGGCAGGAACATTCGTAACGGAATCGTGAAGGCTGGGCCCGCAATTGCTGTGCTGGGTGAAGCTAAAGCCATATTATCA ;根据毕赤酵母密码子偏爱性设计死亡素的基因序列为GGTTCTAAGAAACCAGTCCCCATCATATACTGCAATAGAAGAACGGGTAAGTGTCAGAGAATG。本专利技术步骤一中联接第一个和第二个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGC ;联接第二个和第三个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGCTCCGGT ;联接第三个和第四个原始小分子抗菌肽的GlySerGly的碱基序列为GGTTCTGGT。本专利技术步骤一中5’本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合串联抗菌肽，其特征在于融合串联抗菌肽由Fowlicidin？2、天蚕素B、CecropinA(1？8)？Melittin(1？18)和死亡素四种抗菌肽串联而成，Fowlicidin？2、天蚕素B、CecropinA(1？8)？Melittin(1？18)与死亡素之间用GlySerGly联接。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯兴军，李仲玉，程宝晶，李静，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：