一种抗菌肽、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗菌肽、其制备方法及应用，所述抗菌肽包含如SEQ ID NO.1‑2所示的氨基酸序列。本发明专利技术制备的抗菌肽SJH‑8，具有高效广谱抑菌作用，具有较强的抑制耐药菌的能力，尤其针对金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用；毒性低，可作为抗生素替代品使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种抗菌肽、其制备方法及应用。
技术介绍
抗菌肽是生物防御系统中所产生的对抗外源病原体的肽类物质，广泛存在于动物、植物、微生物中，是机体先天性免疫系统的重要组成部分。迄今为止，已有数千种抗菌肽得到分离和鉴定。抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用。近年来，抗生素的滥用引发了一系列安全问题，如病原菌的耐药性不断增强，种类不断增加，进而严重威胁人类健康。抗菌肽作为一种安全环保的抗生素替代品，在医药行业、饲料和食品添加剂等领域都具有广泛的应用前景。目前已报道的抗菌肽中，有几种来自于唾液乳杆菌的抗菌肽类物质被证实具有高效广谱的抑菌活性和良好的开发潜力，其中部分唾液乳杆菌天然存在于动物的消化道中。现有技术中已报道的研究比较成熟的抗菌肽ABP-118，由唾液乳杆菌L.salivariusUCC118产生，由两条多肽所组成，包括ABP-118α(4096Da)和ABP-118β(4332Da)，分别由abp118α和abp118β基因编码，另外由abpIM基因所编码的免疫蛋白可免疫该抗菌肽对产生菌自身的抑制作用。该机制普遍存在于可产生该抗菌肽的唾液乳杆菌中。组成该抗菌肽的两种多肽均为小分子肽，具有较高的热稳定性，且对很多革兰氏阳性菌、阴性菌及真菌均具有较好的抑菌活性，因而具有较好的应用前景。有些该类抗菌肽的两条多肽分开时不具有抑菌活性或活性较弱，只有在两者混合在一起时才会有很好的抑菌效果。为了进一步开发利用抗菌肽，找到更多的抗菌肽进行研究可以为后期的实际应用奠定基础。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种抗菌肽、其制备方法及应用，所述抗菌肽，所述抗菌肽具有较强的抑制耐药性金黄色葡萄球菌的活性。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种抗菌肽，所述抗菌肽包含如SEQIDNO.1-2所示的氨基酸序列。本专利技术中，所述抗菌肽命名为salivaricinSJH-8，简称SJH-8，包括SJH-8α和SJH-8β两条肽链。所述SEQIDNO.1(SJH-8α)所示的氨基酸序列如下：LysArgGlyProAsnCysValGlyAsnPheLeuGlyGlyLeuPheAlaGlyAlaAlaAlaGlyValProLeuGlyProAlaGlyIleValGlyGlyAlaAsnLeuGlyMetValGlyGlyAlaLeuThrCysLeu；所述SEQIDNO.2(SJH-8β)所示的氨基酸序列如下：LysAsnGlyTyrGlyGlySerGlyAsnArgTrpValHisCysGlyAlaGlyIleValGlyGlyAlaLeuIleGlyAlaIleGlyGlyProTrpSerAlaValAlaGlyGlyValSerGlyGlyPheThrSerCysArg。优选地，所述抗菌肽包含如SEQIDNO.3-4所示的核苷酸序列；所述SEQIDNO.3(SJH-8α)所示的核苷酸序列如下：AAACGTGGACCTAACTGTGTAGGTAACTTCTTAGGTGGTCTATTTGCTGGAGCAGCTGCAGGAGTTCCACTTGGACCAGCTGGTATCGTAGGTGGGGCAAACTTAGGAATGGTAGGCGGAGCGCTTACTTGTTTATAA；所述SEQIDNO.4(SJH-8β)所示的核苷酸序列如下：AAAAATGGTTATGGTGGTAGTGGAAATCGCTGGGTTCACTGTGGAGCTGGCATCGTAGGTGGAGCTTTAATTGGAGCTATCGGTGGACCCTGGTCAGCCGTAGCGGGTGGAGTTTCTGGTGGTTTTACAAGTTGCCGTTAA。优选地，所述抗菌肽包含的氨基酸序列的分子量为α链(SEQIDNO.1)：4074；β链(SEQIDNO.2)：4297。优选地，所述抗菌肽来自于三黄鸡回肠菌群。第二方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第一方面所述的核苷酸序列。第三方面，本专利技术提供一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有如第二方面所述的表达载体。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸乳球菌中的任意一种，优选为乳酸乳球菌。本专利技术中，所述宿主为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌时，除抗菌肽自身(SJH-8α、SJH-8β)以外，应连同其携带的前导肽序列(SJH-8α的信号肽序列：METMETLysGluPheThrValLeuThrGluCysGluLeuAlaLysValAspGlyGly；SJH-8β的信号肽序列：METLysAsnLeuAspLysArgPheThrIleMETThrGluAspAsnLeuAlaSerValAsnGlyGly)和免疫蛋白SJH-8m一起转入宿主中表达；而宿主选用乳酸乳球菌时，用其特有的usp45信号肽替代原前导肽，同时表达免疫蛋白SJH-8m。第四方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：(1)提取三黄鸡回肠菌群宏基因组；(2)根据抗菌肽ABP-118设计引物，以提取的三黄鸡回肠菌群宏基因组为模板进行扩增；(3)将步骤(2)扩增出的片段的前导肽替换为宿主的分泌表达信号肽，再进行全合成整个片段，得到完整的分泌表达抗菌肽；(4)构建分泌表达抗菌肽重组质粒，导入宿主细胞，得到表达抗菌肽的表达工程菌。优选地，步骤(1)所述引物为SEQIDNO.5-6所示的序列；上游引物如SEQIDNO.5所示，下游引物如SEQIDNO.6所示：上游引物(118αF)：5'-ATGATGAAGGAATTTACAGTATTGA-3'，(SEQIDNO.5)；下游引物(118imR)：5'-CTATAGCCACCACATAAAATTTAAC-3'，(SEQIDNO.6)。优选地，步骤(4)所述构建分泌表达抗菌肽重组质粒为将得到的分泌表达抗菌肽连接到pNZ8148质粒的BtgI和HindⅢ克隆位点。第五方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的抗菌肽、如第二方面所述的表达载体、如第三方面所述的宿主细胞在制备动物饲料中的应用。第六方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的抗菌肽、如第二方面所述的表达载体、如第三方面所述的宿主细胞在制备治疗药物中的应用。本专利技术中，所述的药物可以治疗包括但不限于由金黄色葡萄球菌引起的感染。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术制备的抗菌肽SJH-8，具有高效广谱抑菌作用，具有较强的抑制耐药菌的能力，尤其针对金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用；(2)本专利技术制备的抗菌肽SJH-8毒性低，可作为抗生素替代品使用；(3)本专利技术制备的抗菌肽SJH-8为进一步开发利用抗菌肽奠定了基础。附图说明图1是本专利技术抗菌肽相关基因的PCR产物；图2是本专利技术重组质粒构建示意图；图3是本专利技术NZ9000重组子的平板单菌落图；图4是本专利技术工程菌发酵液抑菌效果图。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案，但本专利技术并非局限在实施例范围内。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽包含如SEQ ID NO.1‑2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽包含如SEQIDNO.1-2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽包含如SEQIDNO.3-4所示的核苷酸序列；优选地，所述抗菌肽包含的氨基酸序列的分子量为SEQIDNO.1链：4074；SEQIDNO.2链：4297。3.根据权利要求1或2所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽来自于三黄鸡回肠菌群。4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的核苷酸序列。5.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸乳球菌中的任意一种，优选为乳酸乳球菌。6.一种如权利要求1-3中任一项所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取三黄鸡回肠菌群宏基因组；(2)根据抗菌肽ABP-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘陈立，崔金明，蒙海林，刘复荣，刘明珠，王作伟，杨金芳，邓登，
申请(专利权)人：深圳市澳华农牧有限公司，中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44