可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用制造技术

本发明专利技术提供了可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用。具体而言，本发明专利技术提供了一种红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,M160I,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N。本发明专利技术还提供了一种绿色荧光蛋白，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：N149Y,G160S或G160C,A206K。本发明专利技术的红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白具有良好的光稳定性，可用于高灵敏FRET成像。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于可用于高灵敏FRET成像的荧光蛋白对及其应用。
技术介绍
荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。荧光共振能量转移技术能够实时监控活细胞内生物分子的活性和分子之间的相互反应，为研究复杂细胞信号通路提供了高时间和空间分辨率的有效方法。随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。在生物光学与分子影像
，科学家们一直在努力寻找高效的可用于光学成像的基因编码生物传感器。这些基因编码的生物传感器利用荧光共振能量转移技术实时的监控生物分子的活性和分子之间的相互反应。现在普遍使用的基因编码生物传感器是将青色和黄色荧光蛋白相融合，以青和黄两种颜色的荧光团相搭配，通过荧光共振能量转移实时监控生物分子的活性和分子之间的相互作用。但是这种生物传感器有诸多缺陷，主要表现在以下方面：(1)普通生物传感器中使用的青色和黄色两种荧光蛋白的动态感光范围较低，所以导致成像灵敏度低，很难对细胞内的一些瞬时和微弱生化反应进行监测。(2)光毒性大，在检测活的细胞或样品时，对细胞正常的代谢反应和分子相互作用产生较大的负面影响，导致实验结果出现较大的误差，细胞在长时间成像过程中可能死亡。(3)生物传感器自发荧光干扰。在细胞中成像时，由于传感器本身不可避免的激发青色荧光蛋白的同时可激发细胞内一些内源性分子，比如flavin，会出现自发荧光，所以对实验结果也会造成不同程度的干扰和影响。(4)在激发黄色荧光蛋白时青色荧光蛋白出现光活化。(5)传感器所使用的荧光蛋白对pH敏感，pH发生少许变化时，荧光蛋白可能会失活，荧光会明显减弱。2012年Lam,A.J.等人开发出来一个GFP-RFP对，两种荧光蛋白分别为Clover和mRuby2。该荧光蛋白FRET对与普通的CFP-YFPFRET对相比提高了反应的敏感性，降低了成像时光毒性，与其它的GFP-RFP对相比性质优越，且该方案也已经成功用于活细胞中Zn2+聚集和CaMKIIα活性的成像。但是不足之处为Clover的光稳定弱，在光连续照射下容易光漂白。而mRuby2的光强度也并不高，所以限制了该荧光蛋白FRET对的使用(Lam,A.J.etal.ImprovingFRETdynamicrangewithbrightgreenandredfluorescentproteins.NatMethods9,1005-1012(2012))。在此将该文献的全部内容并入于本专利技术中作为参考文献。
技术实现思路
本专利技术主要是为了寻找高效的可用于光学成像的基因编码生物传感器的荧光蛋白。本专利技术通过定点突变技术，在现有技术荧光蛋白mRuby2和mClover的基础上进行氨基酸位点突变，而得到突变的新红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，实现了蛋白光物理学性质的提高。具体而言，一方面，本专利技术采用定点突变技术在mRuby2基础上进行定点诱变获得了本专利技术的新红色荧光蛋白。本专利技术的该新的红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列(mRuby2的氨基酸序列可参见图1a)相比，具有以下突变位点：M160I。M160I可以让突变蛋白相比mRuby2更亮，在mRuby2基础上具有M160I突变的蛋白具有比未突变的mRuby2较高的光强度。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的新的红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N中的一个或多个的组合。这些突变位点会让蛋白成熟或折叠变好。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的红色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白：(a)具有如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白。其中，所述的“相同功能”是指相比于mRuby2蛋白光物理学性质提高(例如亮度提高)的功能。根据本专利技术的一优选具体实施方案，本专利技术的新的红色荧光蛋白的氨基酸序列参见SEQIDNo.2所示(其中，所述的M160I突变位点对应SEQIDNo.2氨基酸序列的第164位，所述的N33R突变位点对应SEQIDNo.2氨基酸序列的第37位，……，依次类推)，本专利技术中命名该蛋白为mRuby3。本专利技术设计的优选的编码该蛋白mRuby3的基因序列参见SEQIDNo.1所示。mRuby3的激发光谱和发射光谱的峰值分别在约558nm和592nm处，与mRuby2相比出现了蓝移。在峰值处的消光系数为128mM-1cm-1，量子产率为0.45，所以mRuby3的光强度比mRuby2高出35％，所以它是目前为止最亮的单体红色荧光蛋白。除此之外，mRuby3的光稳定性很好，在弧光灯的照射下，mRuby3的半衰期为349秒，长于mRuby2的123秒和TagRFP-T的337秒。在光漂白动力学方面，mRuby3表现出单指数关系，它的解离常数值为4.8，与mRuby2相比耐酸性相似。mRuby3是目前为止亮度最亮和光稳定最好的红色荧光蛋白另一方面，本专利技术还提供了mRuby3的融合蛋白，例如，所述mRuby3与mClover、mClover3、mNeonGreen或EGFP的融合蛋白。本专利技术通过实验证明了mRuby3的融合蛋白能够准确的与哺乳动物细胞系中的重要的亚细胞目标区域相结合。mRuby3在哺乳动物细胞系中所表达的信号强度，比红色荧光蛋白mRuby2、FusionRed和mCherry高出至少100％。mRuby3是一种比mRuby2更高效的荧光共振能量转移受体。另一方面，本专利技术中同样还对绿色荧光蛋白Clover进行了改造，得到光亮度和光稳定性有所提升且可以作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，具有以下突变位点：M160I；优选地，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，还具有以下突变位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,S171H,S173N,I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N中的一个或多个的组合。

【技术特征摘要】
1.一种红色荧光蛋白，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，具
有以下突变位点：M160I；
优选地，该红色荧光蛋白的氨基酸序列与mRuby2的氨基酸序列相比，还具有以下突变
位点：N33R,M36E,T38V,K74A,G75D,M105T,C114E,H118N,Q120K,H159D,S171H,S173N,
I192V,L202I,M209T,F210Y,H216V,F221Y,A222S,G223N中的一个或多个的组合。
2.根据权利要求1所述的红色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白：
(a)具有如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且与(a)具有
相同功能的由(a)衍生的蛋白。
3.一种绿色荧光蛋白，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，具
有以下突变位点：N149Y；
优选地，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突变
位点：G160S或G160C；
更优选地，该绿色荧光蛋白的氨基酸序列与Clover的氨基酸序列相比，还具有以下突
变位点：A206K。
4.根据权利要求3所述的绿色荧光蛋白，其为选自以下(a)或(b)的蛋白：
(a)具有如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5或SEQIDNo.6所示氨基酸序列的蛋白；
(b)...

【专利技术属性】
技术研发人员：储军，郭育奇，张楚秋，王慧娜，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44