本发明专利技术涉及一种类海马抗菌肽hkplpl-2，其包含源于大海马的抗菌肽hkplp保守区域GIVHAGKT-NH2的序列。主要对抗菌肽hkplp进行同源比对，分析出保守区域后，以hkplp为主体，与抗菌肽piscidin-like antimicrobial peptide precursor[Epinephelus bleekeri]的保守区域IHRRR-NH2杂合，设计并合成了hkplpl-2，序列为：GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG。本发明专利技术的有益效果是：本发明专利技术所述的抗菌肽，具有高效广谱抑菌作用，低毒性。可作为抗生素替代品使用。
【技术实现步骤摘要】
专利申请号：
：本专利技术为一种类海马抗菌肽hkplpl-2。
技术介绍
：近年来随着抗生素的滥用，抗药菌越来越多，耐药性日益严重。据资料显示，在美国临床上分离到的金葡菌有95％对青霉素耐药，50％以上对甲氧西林耐药(Frindkin SK，Gaynes RP.Antimicrobial resistance in intensive care units.Clin Chest Med.1999，20(2)：303-316)；2012年我国临床检测发现，金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌中甲氧西林耐药株(MRSA和MRCNS)的检出率平均分别为47.9％和77.1％(2012年中国CHINET细菌耐药性监测Chin J Infect Chemother，2013，13(5)：321-330)。这种情况逐渐严重威胁着人类的生产生活，从而导致人们对此潜在威胁意识的觉醒及食品安全级别意识的提高，产生了替代旧抗生素且绿色环保、安全抗耐药的新一代抗生素的迫切需要。抗菌肽是生物体内免疫防御系统的重要组成部分，是一类小分子肽，被称为安全的天然抗生素，具有抗菌谱广、无耐药性、热稳定好、水溶性高、无毒无残留等优点。据统计，目前我国尚有多达20种人畜共用或畜禽专用的抗生素作饲料添加剂，除此之外，抗菌肽还被并将被广泛用于化妆品、食品保鲜剂、药物、转基因表达等与人类生产生活当中。将抗菌肽产品开发成新的代替传统抗生素的产品，将给我国的相关行业注入一针强心剂，推动我国相关行业不断向前发展。抗菌肽hkplpl-2序列：GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG；分子式：C113H177N37O23，分子量MW[AV]：2421.8；不含有稀有氨基酸和外源化学成分，具有免疫原性小、水溶性好、广谱杀菌等优点，能耐受胃肠道中蛋白酶及肽酶的降解。特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响。可以在产品保存过程中持续发挥其功能，保持产品品质，延长贮存期限。Hkplpl-2可以作为新一代的添加剂，是很好的传统抗生素替代品，能有效得解决人和动物药残和病原菌耐药性的问题。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种人工构建的抗菌肽序列。我们在具有很好的抗菌活性的抗菌肽hkplp原有序列的基础上，我们对其进行人工改造设计，根据同源性比对，分析出保守序列GIVHAGKT。与抗菌肽plapp(piscidin-like antimicrobial peptide precursor[Epinephelus bleekeri])的保守序列IHRRR进行杂合，设计出十种人工抗菌肽，通过筛选，最终获得序列：GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG。本专利技术的方法包括如下步骤：步骤(1)本专利技术利用生物信息学方法对抗菌体hkplp进行BLAST比对，分析并选出保守区域P1：GIVHAGKT；步骤(2)选择与其功能相近的抗菌肽plapp的保守区域P2：IHRRR，与hkplp进行杂合设计；步骤(3)采用化学合成法合成hkplpl系列抗菌肽十组；步骤(4)采用平板培养法对合成抗菌肽hkplpl系列设计抗菌肽进行筛选，并对效果明显的抗菌肽进 行对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α、沙门氏菌、动物致病大肠杆菌和医院临床病例分离的大肠埃希菌、溶血葡萄球菌的抗菌实验如图1所示，结果显示抗菌肽hkplpl-2对以上各菌均有良好的抗菌活性。步骤(5)中采用倍比稀释的方法配制不同浓度的hkplpl-2溶液，加入到培养菌液中培养16h后测OD630值，确定人工合成hkplpl-2对不同菌株的最小抑菌浓度MIC。附图说明：图为合成抗菌肽hkplpl-2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α、沙门氏菌、动物致病大肠杆菌和医院临床病例分离的大肠埃希菌、溶血葡萄球菌的抗菌实验结果，图中：1表示氨苄青霉素的抗菌活性；0为阴性对照ddH2O；2、3、4为人工合成抗菌肽的抗菌活性。具体实施方式：以下给出实施例对本专利技术进行具体描述，但需指出的是本专利技术不限于具体实施例，实施例只用于对本专利技术的进一步说明，不能理解为对本专利技术范围的限制。具体实施例说明：实施例1：Fmoc-Arg(pbf)-氨基树脂的制备将氨基树脂Fmoc-Rink Amide 10.03g，替代度0.84mmol/g，加入到固相反应器中，加入DMF浸泡，使其充分溶胀30min，抽干，加20％哌啶/DMF溶液脱Fmoc 5min、15min，用DMF、DCM、MeOH洗涤干净。取11.1g Fmoc-Arg(Pbf)-OH，2.24gHOBt，6.14gHBTU用DMF溶解后加入到反应器中平衡5min，加入6.0ml DIPEA室温反应1小时，抽干，先后用DMF、DCM、MeOH各洗涤3次，干燥称重17.12g Fmoc-Arg(pbf)-Rink Amide树脂，检测取代度为0.67mmol/g。实施例2：hkplpl-1-氨基树脂的制备将上述树脂放于接肽瓶中，加入20％哌啶/DMF溶液脱Fmoc 5min、15min，用DMF、DCM、MeOH洗涤干净。然后按序列GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRG-NH2的顺序依次接Fmoc保护的氨基酸，反应体系摩尔比为Fmoc-AA：DIC.HOBt按1∶1∶1投放，在此例中Fmoc-AA按树脂量的3倍加入，每次DIC加4.10g左右，HOBt加4.27g左右。期间依次20％哌啶/DMF脱除Fmoc保护基团2次，第一次反应5min，第二次反应15min；每一步氨基酸缩合反应一次2-4小时，均采用Kaise Test检测反应是否缩合完全，如显色反应呈阳性重复缩合该氨基酸，序列缩合最后直接脱除Fmoc保护基团，DMF、DCM、MeOH洗涤几次。实施例3：hkplpl-1粗品的制备Hkplpl-1氨基树脂用TFA：Tis：Phenol按体积比95∶2.5∶2.5的混合溶液处理肽树脂3-4小时，把肽从树脂上切下来及切除侧链保护基，浓缩至干后用冰乙醚析出固体，离心干燥得粗品29.51g。实施例4：hkplpl-1成品的制备Hkplpl-1粗品用1％醋酸溶液溶解后，离心取上清过G10柱，收集抗菌肽hkplpl-1峰浓缩干燥得成品17.71g。纯度大于60％，总收率达54％。实施例5：按实施例1至4合成其余hkplpl系列的多肽。序列如下：hkplpl-2：GFLFHGLLHAGKVIHGIVHRRGhkplpl-3：GLIFKGIVHAGKT LHRVIHRRGhkplpl-4：GLFIKGIVHAGKT LHRVIHRRGhkplpl-5：GLIKFGIVHAGKT LHRVIHRRRhkplpl-6：GLIFKGIVHAGKT KHRVIHRRRhkplpl-7：GLIFKGIVHAGKT HLRVIHRRRhkplpl-8：GILKFGIVHAGKT LHRVIHRRRhkplpl-9：GILKFGIVHAGKT IKRVIHRRRhkplpl-10：GLIFHGIVHAGKT LKRVIHRRR实施例6：hkplpl系列筛选从YPD平板上挑取PCR鉴定为阳性的单菌落接种于100mlBMGY培养基，30℃振荡培养至OD6002～6，去上清，加入20mlBMMY培养基重悬菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种类海马抗菌肽hkplpl‑2的化学合成方法及其部分抗菌谱功能，主要包括以下步骤：1)以Fmoc‑氨基树脂为载体，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得hkplpl‑2‑氨基树脂，期间依次脱除Fmoc保护基团；2)用三氟乙酸混合溶液把肽从树脂上切下，处理干燥得粗品；3)粗品过G10柱纯化，浓缩干燥获得成品；4)测定人工合成的抗菌肽hkplpl‑2的抗菌谱；5)测定人工合成的抗菌肽hkplpl‑2的最小抑菌浓度(MIC)。
【技术特征摘要】
1.一种类海马抗菌肽hkplpl-2的化学合成方法及其部分抗菌谱功能，主要包括以下步骤：1)以Fmoc-氨基树脂为载体，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得hkplpl-2-氨基树脂，期间依次脱除Fmoc保护基团；2)用三氟乙酸混合溶液把肽从树脂上切下，处理干燥得粗品；3)粗品过G10柱纯化，浓缩干燥获得成品；4)测定人工合成的抗菌肽hkplpl-2的抗菌谱；5)测定人工合成的抗菌肽hkplpl-2的最小抑菌浓度(MIC)。2.根据权利要求1所述方法，其特征是：固相合成连接氨基酸过程中，Fmoc保护基团脱除剂用20％哌啶/DMF，Fmoc-AA按缩合量的2-5倍量加入，其中Fmoc-AA、缩合剂比例按摩尔比1∶1投放，缩合反应每次2-4小时。3.根据权利要求1和2所述方法，其特征是：在氨基酸连接过程中，每一步氨基酸缩合均采用Kaise Test检测反应是否缩合完全，如显色反应呈阳性重复缩合该氨基酸。4.根据权利要求1和2所述方法，其特征是：缩合剂体系采用DIC+A或A+B+C，其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、P...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁东，张广献，詹朝宇，刘瑞兰，
申请(专利权)人：广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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