一种低分子量胶原蛋白的制备方法。本发明专利技术涉及通过前处理、分子筛层析及离子交换柱分离而获得低分子量的胶原蛋白肽的制备方法。胶原蛋白是保健产品中重要的功能因子，影响胶原蛋白功效的主要因素为来源、工艺和分子量，其中分子量的分布又与工艺直接相关。相对分子量是水解胶原蛋白质量的重要指标，需对其进行深入研究，确定水解胶原蛋白的相对分子量与活性的关系。本发明专利技术是对来源于鱼皮如鳕鱼皮、罗非鱼皮等下脚料，通过鱼皮杂蛋白的去除、鱼皮脂肪的去除、鱼皮胶原蛋白的酶解、样品胶原蛋白酶解多肽液的分子筛层析分离纯化、离子交换层析分离纯化，获得高纯度的不同范围分子量的胶原蛋白样品。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】。本专利技术涉及通过前处理、分子筛层析及离子交换柱分离而获得低分子量的胶原蛋白肽的制备方法。胶原蛋白是保健产品中重要的功能因子，影响胶原蛋白功效的主要因素为来源、工艺和分子量，其中分子量的分布又与工艺直接相关。相对分子量是水解胶原蛋白质量的重要指标，需对其进行深入研究，确定水解胶原蛋白的相对分子量与活性的关系。本专利技术是对来源于鱼皮如鳕鱼皮、罗非鱼皮等下脚料，通过鱼皮杂蛋白的去除、鱼皮脂肪的去除、鱼皮胶原蛋白的酶解、样品胶原蛋白酶解多肽液的分子筛层析分离纯化、离子交换层析分离纯化，获得高纯度的不同范围分子量的胶原蛋白样品。【专利说明】
本专利技术涉及通过前处理、分子筛层析及离子交换柱分离而获得低分子量的胶原蛋白的制备方法。
技术介绍
胶原蛋白是保健产品中重要的功能因子，拟对目前影响胶原蛋白质量的主要因素进行探索性试验。影响胶原蛋白功效的主要因素为来源、工艺和分子量，其中分子量的分布又与工艺直接相关。相对分子量是水解胶原蛋白质量的重要指标，需对其进行深入研究，确定水解胶原蛋白的相对分子量与活性的关系。另现有的功能文献表明不同的氨基酸组成和分子量的产品有不同的美容功效，而这些需通过工艺和复合技术达到全面的美容功效。因此拟对胶原蛋白的工艺条件进行研究，以不同来源鱼皮为原料，对原料的的前处理、酶解工艺和酶解液的分离手段进行研究。
技术实现思路
来源于鱼皮如鳕鱼皮、罗非鱼皮等下脚料，通过鱼皮杂蛋白的去除、鱼皮脂肪的去除、鱼皮胶原蛋白的酶解、样品胶原蛋白酶解多肽液的分子筛层析分离纯化、离子交换层析分离纯化，获得高纯度的不同范围分子量的胶原蛋白样品。 1.根据本专利技术，鱼皮胶原蛋白的提取的步骤为: (I)鱼皮杂蛋白即非胶原蛋白的去除:称取若干鱼皮粉按1: 10?50(g/ml)加入0.01?IM的NaOH在O?30摄氏度下浸泡2?48h，用双蒸水反复浸洗直至中性，滤干。称重。 (2)鱼皮脂肪的去除:经上述处理的鱼皮粉按1: 10?50(g/ml)加入I?50%正丁醇在O?30摄氏度下浸泡2?48h，用双蒸水反复浸洗直至中性，滤干。称重。 (3)鱼皮胶原蛋白的提取:经过上述处理的鱼皮按0.1% -15%的比例加入木瓜蛋白酶(pH最佳是7左右)，37摄氏度(是木瓜蛋白酶的最佳活性温度)水浴4-12h，每30min搅拌一次。倒入事先称重的滤纸，完全滤干，称重，计算鱼皮溶解率。 2.根据本专利技术，上述鱼皮胶原蛋白酶解多肽液的分子筛层析分离纯化步骤为: (I)凝胶的选择:本专利技术根据鱼皮胶原蛋白层析物质分子量的大小选择G-25葡聚糖凝胶 (2)凝胶的预处理:本专利技术选择称取1-1kg的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱(或室温)中充分膨胀0.5-2天，为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min,倾去沉淀的粒子,如此反复数次。 (3)装柱:本专利技术层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25?100倍。 (4)加样与洗脱:本专利技术的样品经过0.25-0.45um滤头过滤，上样体积为每次l-5ml,流速0.5-2.5ml/min,用超纯水洗脱。测定收集样品的浓度。 3.根据本专利技术，上述分子筛层析后的样品进行离子交换层析分离纯化实验的步骤为: 本专利技术的操作流程如下: 填料DEAE预处理一湿法装柱一平衡色谱柱一柱头上样一梯度洗脱一收集洗脱峰—检测峰蛋白浓度 (I)本专利技术填料DEAE的预处理步骤为: 称取一定量的DEAE纤维素粉，用蒸馏水浸泡2?4h，进行浮选，倒去上层水相后，加入蒸馏水洗净，用真空泵抽干后，用0.l-2mol/L HCl溶液浸泡洗涤0.5_3h，抽干，用大量蒸馏水洗涤至接近中性。再用0.l-2mol/L NaOH溶液浸泡洗涤0.5_3h，抽干，同样用大量蒸馏水洗涤至接近中性。然而再用0.l-2mol/LHCl溶液浸泡，进行改型，抽干，蒸馏水洗涤至接近中性。最后用含l-5mol/L尿素的0.02mol/LNaAC-HAC缓冲溶液洗涤数次，洗至恒定pH，浸泡在含l-5mol/L，尿素的0.02mol/L NaAC-HAC缓冲液中。最好每次洗脱后都要进行该步处理。 (2)本专利技术装柱、平衡的步骤为: 选择16mmX 200mm玻璃层析柱,洗净,垂直安装在铁架台上,关闭柱出口。向柱中加入含l-5mol/L尿素的0.02mol/L醋酸钠-醋酸缓冲溶液约5cm柱高(注意柱的下端必须充满液体，不得有气泡)。打开柱出口，从柱的上面不断缓慢的加入已处理好的DEAE纤维素溶液，控制流速在0.5?2.0mL/min,直至距离柱的上端约8cm。接上装有l_5mol/L尿素的0.02mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液的洗脱瓶，平衡2h-10h。关闭柱出口，用滴管吸走上端的缓冲液，留下一层约2mm缓冲液铺盖DEAE柱床表面。接上AKTA的系统，用注射器或者直接进样口进样。 (3)本专利技术的洗脱步骤为: 吸附完毕，接上含l-5mol/L尿素的0.02mol/L醋酸钠-醋酸缓冲溶液洗脱瓶，让其淋洗约0.5-10倍柱体积的缓冲液，控制流速在0.5-2.5mL/min，除去不吸附的杂蛋白。然后接上梯度洗脱瓶，洗脱瓶装200mL含l-5mol/L尿素的0.02mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，储备瓶装200mL含1.5mol/L NaCl和l-5mol/L尿素的0.02mol/L醋酸钠-醋酸缓冲溶液。将洗脱瓶和储备瓶水平放置在梯度洗脱装置上。开动梯度洗脱装置，使洗脱液的NaCl由储备瓶流向洗脱瓶时，能及时混匀。洗脱液的流速控制在0.5-2.5mL/min。仪器自动收集。冻干机分批冻干。 【具体实施方式】 实施例1: 鳕鱼鱼皮胶原蛋白的提取 (I)鱼皮杂蛋白即非胶原蛋白的去除:称取30g鳕鱼皮按1: 30(g/ml)加入0.1M的NaOH在4摄氏度下浸泡24h，用双蒸水反复浸洗直至中性，滤干。称重24g。 (2)鱼皮脂肪的去除:去除杂蛋白鳕鱼皮按1: 30(g/ml)加入10%正丁醇在4摄氏度下浸泡24h，用双蒸水反复浸洗直至中性，滤干。称重是18g。 (3)鳕鱼皮胶原蛋白的提取:经过上述处理的鱼皮粉按10倍体积加入双蒸水，按10%的比例加入木瓜蛋白酶(pH最佳是7左右)，37摄氏度(是木瓜蛋白酶的最佳活性温度)水浴12h，每30min搅拌一次。倒入事先称重的滤纸，完全滤干，称重，计算鱼皮溶解率。 鳕鱼皮溶解率计算公式是:鱼皮溶解率= ★100% 实施例2: 依据实施例1获得样品胶原蛋白酶解多肽液的分子筛层析分离纯化 胶原多肽的分离纯化:葡聚糖凝胶G-25分离纯化复合多肽，在波长221nm处测定所分离的各组分。 (I)凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择G-25葡聚糖凝胶 (2)凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱(或室温)中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。本实验中称取50g凝胶，膨胀24h。为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次。 (3)装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术为一种低分子量胶原蛋白的制备方法，其特征在于选取鱼类的鱼皮粉作为原料，包括鳕鱼皮、罗非鱼皮等。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广东中大南海海洋生物技术工程中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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