超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用制造技术

本发明专利技术属于关节假体周围感染诊断技术领域，具体提供了超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。本发明专利技术采用超顺磁性纳米颗粒替代胶体金作为标记物，形成一种新型的磁免疫层析技术。达到的有益效果是：通过本发明专利技术的应用所提供的PJI诊断试纸具有高敏感性、高特异性、并且检测时间短、检测方便，定性检测方面：定性检测限可低于20ng/mL，检测时间少于10min；定量检测方面：定量检测限低于10ng/mL，检测时间少于20min。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于关节假体周围感染诊断
，具体涉及一种超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。
技术介绍
关节假体周围感染(PeriprostheticJointInfection，PJI)被认为是人工关节置换术后灾难性的并发症。有文献报道，关节置换手术后大约1％～3％的患者会发生PJI。随着PJI发生率的增加，给病人和医疗系统都带来了巨大的经济负担。PJI的及早诊断对于PJI的治疗具有重大意义，然而目前仍没有一种灵敏、准确、快速、简便的方法诊断假体周围感染。目前较常用的MSIS诊断标准主要是基于临床表现，外周血及关节液的实验室检查，组织病理学检查，但是依旧存在“假阴性”率高且复杂不简便的缺点。由于抽血的易行性，血清学检测是诊断关节假体周围感染的中药筛查手段。除出现与关节腔相通的窦道外，两次培养结果为同一细菌，被认为是诊断PJI的金标准，所以细菌培养结果十分重要。尽管细菌培养十分重要，但细菌培养的阳性率却并不高，且有一定假阳性率。因此关节液的分析及检测也是不可忽略的方面，关节液为脓性提示存在关节假体感染，但这一指标过于主观，临床上很难准确界定。相对客观的指标主要有关节液白细胞计数及分类计数。尽管这两项指标cutoff值的界定各文献略有不同，但多个研究均证实关节液白细胞计数及分类计数对PJI的诊断有较高的准确性[14-16]。关节液C反应蛋白(SynovialCRP)被多项研究证实在PJI的诊断中有很高的敏感性和特异性[17-19]。但与血清CRP相比，关节液CRP并没有显示出更高的诊断效能。此外，对于部分无法获得关节液的部分病例，术中取假体周围组织，进行组织学分析显得十分重要。尽管术中冰冻病理有很高的价值，但也会受到术者取组织部位的经验，病理分析人员的经验，甚至染色方法的影响。白细胞酯酶(LeukocyteEsterase，LE)早在上世纪80年代就用于尿路感染的诊断。并有文献报道了其良好的敏感性和特异性。Parvizi等人在2011年首先将LE试纸条应用在膝关节假体周围感染中。方法是将1滴关节液滴在尿试纸条“白细胞酯酶(LeukocyteEsterase)”小格上，1分钟后判断颜色变化。文章指出以“++”(试纸变为深紫色)作为诊断标准，敏感性80.6％，特异性100％，阳性预测值100％，阴性预测值93.3％。随后一些学者也陆续证实了LE试纸应用在髋、膝关节PJI诊断中都有着良好的敏感性和特异性。目前的白细胞酯酶试纸是基于酶促反应的颜色变化，主要原理是测试关节液中的白细胞酯酶含量。虽已证明白细胞酯酶有着很好的敏感性与特异性，但白细胞酯酶试纸结果易受风湿免疫性疾病影响，且颜色变化的判读易受血液等因素干扰，在判读过程中存在一定的主观性。近年来，关节液生物标记物作为诊断PJI的方法越来越引起学者重视，其中α-防御素(α-defensin)即称为继白细胞酯酶后的一个新的研究热点。尽管这些敏感性和特异性高的生物标记物已经渐渐被人们认识和发现，但检测方法依旧主要依赖于酶联免疫反应(ELISA)，主要限于实验室的研究。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。虽然ELISA在临床诊断检测方面应用广泛，但是一套试ELISA剂盒(96孔板)价格昂贵，约数千元。而PJI并非高发病，各中心目报告的结果均为预先留存关节液标本，集齐一定数量的标本后统一检测，测试周期非常长，且需要经过包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色及终止反应这一系列过程繁琐的操作和酶联免疫反应后才能进行结果的判定，因此尚无法直接应用于临床，所以相对于目前临床上所用的LE试纸这种快速、准确、简便的诊断方法，ELISA检测技术并不十分经济快捷。综上所述，一种应用于PJI诊断的高敏感性、高特异性、检测时间短、检测方便的新型免疫层析技术亟待开发。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术提供了一种新型免疫层析技术，该新型免疫层析技术中采用超顺磁性纳米颗粒替代传统的胶体金标记物，以提升免疫层析技术的分析能力，最终获得用于PJI诊断的高特异性、高敏感性、检测时间短、检测方便的以超顺磁性纳米颗粒作为标记物的新型PJI诊断试纸。免疫层析技术始于上世纪80年代，它由于操作简便、检测快速、成本极低等优势而得到迅速发展。传统的免疫层析系统中主要以胶体金作为标记物，检测灵敏度不高，只能定性或半定量，且受复杂基质影响后，易出现假阳性结果。本专利技术的技术构思是采用超顺磁性颗粒替代胶体金作为标记物以提升免疫层析分析技术的检测能力。基于以上技术构思，本专利技术首先提供了超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。PJI诊断试纸的具体结构例如检测线和质控线的布置、吸水垫、硝酸纤维膜等的布置皆为行业通用诊断检测试纸的布置方法，本专利技术中不再进行赘述。为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为α-防御素的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的具体方法为：称取50μg的α-防御素的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，120转/分在37℃条件下摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为中心粒细胞弹性蛋白酶-2的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联的具体方法为：称取150μg的中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为杀菌/渗透增强蛋白的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体偶联的具体方法为：称取200μg的杀菌/渗透增强蛋白的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。得到的超顺磁性纳米颗粒和杀菌/渗透增强蛋白的抗体的偶联复合物可以置于4℃的磁性颗粒保存液中保存备用。为了提升对PJI诊断的诊断特异性和敏感性，优选方案，所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体偶联的复合物。进一步优选，所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为乳铁蛋白的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和乳铁蛋白的抗体偶联的具体方法为：称取100μg的本文档来自技高网...

【技术保护点】
超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。

【技术特征摘要】
1.超顺磁性纳米颗粒作为标记物在制备PJI诊断试纸中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的复合物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为α-防御素的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和α-防御素的抗体偶联的具体方法为：称取50μg的α-防御素的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸的生物标记物为超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联的复合物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述PJI诊断试纸中的检测线位置的固定抗原为中心粒细胞弹性蛋白酶-2的牛血清白蛋白偶联物；所述超顺磁性纳米颗粒和中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体偶联的具体方法为：称取150μg的中心粒细胞弹性蛋白酶-2的抗体与100μL的超顺磁性纳米颗粒混合偶联，在37℃条件下以120转/分摇床反应3h，再用5％的BSA封闭30min即得。6.根据权利要求1所述的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈继营，沈研，丁芳，付君，李睿，刘侃，
申请(专利权)人：陈继营，
类型：发明
国别省市：北京;11