本发明专利技术公开了一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。本发明专利技术还公开了上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物免疫
，尤其涉及一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体，还涉及上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。
技术介绍
间皮素(mesothelin，MESO)前体多肽是通过磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol，GPI)锚定的一种糖基化的细胞表面蛋白，可以被裂解为30kDa N端的分泌多肽和40kDa C端多肽仍与细胞表面结合，GPI锚定方式，被命名为间皮素连接蛋白。Mesothelin在某些肿瘤细胞中高表达，尤其是间皮瘤细胞、胰腺肿瘤细胞和卵巢癌细胞，而在正常组织表达受限，因此成为肿瘤治疗的理想靶标。mesothelin的功能是未知的，在mesothelin缺陷型小鼠中，没有明显的复制，血液异常或是解剖异常。已有实验证实抗MESO的抗体可以阻止相关肿瘤细胞的增殖及转移等。所以制备抗MESO的抗体。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体。本专利技术的目的又在于提供一种编码上述人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的DNA分子。本专利技术的目的又在于提供一种含有能编码上述人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的DNA分子表达载体。本专利技术的目的又在于提供一种被上述的表达载体所转化的宿主细胞。本专利技术的目的还在于提供一种编码人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的应用。为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研究，包括：人鼠嵌合Fab噬菌体抗体库的筛选，抗MESO特异性抗体的纯化，抗MESO全分子抗体IgG的制备、表达及纯化，抗MESO全分子抗体IgG的特性分析；最终获得了一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。优选地，所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。本专利技术还提出的一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体，包含轻链恒定区和重链恒定区，所述的轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，所述的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。本专利技术还提出的一种DNA分子，其编码上述的全分子IgG抗体的重链或/和轻链。优选地，其编码轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。本专利技术还提出的一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。本专利技术还提出的一种宿主细胞，被上述的表达载体转化。优选地，该宿主细胞可以是被上述的表达载体转化的293Freestyle细胞。本专利技术还提出的上述的全分子IgG抗体在制备与MESO相关的肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的用途。本专利技术通过杂交瘤技术获得对MESO具有高度亲和力的鼠源IgG抗体，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并将所述抗体的重链和轻链可变区与含有人IgG1抗体恒定区的表达载体连接，最终获得了具有特异的抗原结合性和在细胞学上证明抗体可以抑制肿瘤细胞的增殖。本专利技术提供了一种具有高特异性、良好亲和力的抗MESO的人鼠嵌合单克隆抗体。MESO在某些肿瘤细胞中高表达，尤其是间皮瘤细胞、胰腺肿瘤细胞和卵巢癌细胞，而在正常组织表达受限，因此本专利技术的抗MESO抗体可应用于有关MESO阳性的肿瘤的诊断和治疗。本专利技术以MESO为靶分子，利用杂交瘤技术制备鼠源抗体，然后利用基因工程技术制备人鼠嵌合抗体。对制备的人鼠嵌合抗MESO抗体做功能鉴定，显示该抗体能够与MESO特异性结合，体外细胞实验证实抗体能够抑制MSEO阳性的肿瘤细胞的增殖。附图说明图1为本专利技术实施例1所得纯化人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的SDS-PAGE检测结果；其中M为蛋白分子量标准品，1为抗MESO抗体，2为细胞培养上清，3为流穿；可见使用Pro.A柱纯化抗MESO抗体的纯度高。图2为本专利技术实施例1所得抗MESO抗体的酶联免疫吸附试验检测结果，可见抗MESO抗体与MESO蛋白的结合能力较强。图3为本专利技术实施例1所得抗MESO抗体的免疫印迹鉴定结果；其中1为抗MESO抗体与MESO阳性人肺癌细胞NCI-H226；2为抗MESO抗体与MESO阴性的人正常上皮细胞BEAS-2B；可见抗体与MESO蛋白有特异性结合能力。图4为本专利技术实施例1所得抗MESO抗体的亲和力检测结果，KD值为5.561×10-10M。图5为本专利技术实施例1所得抗MESO抗体对MESO阳性人肺癌细胞NCI-H226的杀伤作用，实验结果显示抗体浓度在15μmol/mL时可以使细胞存活率降低至25％，而对正常的肺上皮细胞没有影响。具体实施方式下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体的制备1)用MESO抗原免疫小鼠，通过杂交瘤技术获得抗MESO的鼠源单克隆抗体，然后通过PCR扩增测序获得抗体的可变区序列。2)根据已获得的抗体的重轻链可变区序列，设计引物。3)扩增抗MESO抗体重链、轻链。以上述制备的鼠源IgG为模板，分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增全分子人源抗体重链、轻链基因。(1)PCR反应体系如下：反应条件如下：(2)2％琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收。(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。4)双酶切IgG表达质粒IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk(购自Invivogen公司)包含IgG1型人源的重链和轻链(Kappa)恒定区碱基编码序列。(1)pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk模板载体的双酶切反应体系如下：反应条件为：37℃酶切过夜。(2)1％琼脂糖凝胶电泳，紫外下切胶回收。(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。5)Infusion PCR重组表达质粒反应体系如下：反应条件为：50℃孵育15min。取5μL反应液转化感受态细菌，铺于相应抗性的平板上，次日挑克隆送测序。将测序结果正确的克隆保存菌种并扩大培养，提取质粒。6)抗MESO抗体的表达(1)取50μg重组后的重链质粒于1mL的Opti-MEM培养基中，取50μg的轻链质粒于1mL的Opti-MEM培养基中，取200μL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培养基中，将上述三种混合液室温静置5min。(2)然后将两个质粒混合液混合均匀后，补加500μL的Opti-MEM培养基混合均匀后直接加入转染试剂293Fectin的混合液，混合均匀后静置20min。期间处理293F细胞，将293F细胞离心后用293F Expres本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，其特征在于，(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
【技术特征摘要】
1.一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，其特征在于，(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。2.根据权利要求1所述全分子IgG抗体，其特征在于，所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯振卿，唐奇，许国贞，刘振云，朱进，蒯兴旺，章明炯，
申请(专利权)人：安徽未名细胞治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。