公开了一种用于选择性检测生物流体样品中的1,25-二羟基-维生素D的测定方法。根据本发明专利技术的方法，测试样品的pH被调节至6-9并且将包含维生素D受体的配体结合结构域(VDR-LBD)的受体蛋白添加至测试样品中，由此获得了VDR-LBD/1,25-二羟基维生素D复合物的制剂，其中VDR-LBD部分相对于未结合的VDR-LBD发生了构象变化。然后，通过能够特异性地结合至已结合至1,25-二羟基维生素D的VDR-LBD的捕获部分来检测VDR-LBD/1,25-二羟基维生素D复合物。还公开了用于实施本发明专利技术的方法的测定试剂盒以及抗体。本发明专利技术的测定法优选为夹心免疫测定法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于在生物流体样品如全血、血浆、血清或尿液样品中检测总 1，25-二羟基维生素 D的方法和试剂盒。 更具体地，本专利技术涉及一种免疫检测方法和试剂盒以及涉及相关的抗体，其适合 于检测可能含有1，25-二羟基维生素 D及其他非活性形式的维生素 D如25-羟基维生素 D 的生物流体样品中的总1，25-二羟基维生素 D。
技术介绍
维生素 D是一种类固醇激素，其在骨骼代谢和钙稳态中起着根本性的作用。在人 类和动物中，维生素 D的主要形式为维生素 D3 (胆钙化留醇）和维生素 D2 (麦角钙化留醇）。 维生素 D3主要是在皮肤中由7-脱氢胆留醇响应于太阳紫外线-B(UVB)的暴露而合成的， 但是发生从膳食来源如油性鱼类即三文鱼和鲭鱼的维生素摄入。维生素 D2主要是在来源 于真菌和植物来源的膳食以及从补充剂（例如Drisdol?或Sterogyl 15 "A"）中获得的。 不论来源，维生素仏和D 3向生物活性化合物的转化需要两个独立的羟基化步骤。 在肝脏中，酶25-羟化酶将维生素 D转化为25-羟基维生素 D (下文中指定为"25 (OH) D"）。 这种中间代谢物是该激素的主要循环形式并且充当用于进一步羟基化至生物活性代谢物 1，25-二羟基维生素 D (下文中指定为" 1，25 (OH) 2D"）的蓄池。 后一步骤主要发生在肾小管细胞中并且通过酶l-α -羟化酶催化。1，25 (OH)2D的 血浆浓度由包括血清甲状旁腺激素（PTH)的多种因素高度调控，并且它们通常比前体化合 物25 (OH) D低约1000倍。 由于它们的亲油性质，大多数的维生素 D及其代谢物在结合至维生素 D结合蛋白 质（DBP)(也已知为Gc-球蛋白和白蛋白（10-20%))的血流中循环（80-90%)。DBP对于 维生素 D代谢物具有高亲和力（对25 (OH) D和24, 25 (OH) 2D为Ka = SxlO8M-1,对1，25 (OH) 2D 和维生素 D为Ka = AxIO7IT1)，由此在正常情况下，仅约0. 03 %的25 (OH) D和24, 25 (OH) 2D 以及约0. 4%的1，25 (OH)2D为游离形式。 1，25 (OH)2D的生物效应主要通过这种生物活性激素与特异性细胞内维生素 D受体 (VDR)的结合来介导的，其主要通过调节启动子含有称为维生素 D响应元件（VDRE)的特异 性DNA序列的基因的表达来发挥作用。 维生素 D受体（VDR)是一种属于核受体（NR)的超家族的配体依赖性转录调节子。 如同这种受体家族的其他成员，VDR具有包含氨基末端A/B结构域、高度保守的DNA结合 结构域（DBD)、柔性接头区域和更具可变性的C-末端配体结合结构域（LBD)的模块化结构 (Mangelsdorf DJ et ah ,1995, Cell 83 (6): 835-9)。C-末端 LBD 为球状多功能结构域，其 负责激素结合、与视黄醇X受体（RXR)的二聚化以及与共抑制因子和共激活因子的相互作 用，它们一起对于转录活性的调控是至关重要的（Haussler MR, et al. 1998, J Bone Miner Res. 13(3) :325-49) 〇 已经结晶了 VDR的配体结合结构域（LBD)并且解析了其结构（Rochel N，mirtz JM，Mitschler A，Klaholz B，Moras D The crystal structure of the nuclear receptor for vitamin D bound to its natural ligand. Mol Cell 2000 ;5:173-179)〇 配体与VDR的结合引起在受体的配体结合结构域处的构象变化，其反过来提高了 VDR与靶基因的启动子区域中的维生素 D-响应元件（VDRE)上的辅因子视黄醇X受体（RXR) 的异源二聚化。这反过来引起了启动子向转录机制的开放（Glenville J.et al.，1998 Physiological Reviews 78 (4):1193-1231)〇 已知核受体配体结合结构域（LBD)具有高含量的α螺旋，其响应于配体结合可发 生大的构象变化，形成疏水口袋。最近，通过NMR谱解答了褐家鼠 （Rattus norvegicus)配 体结合结构域（r-VDR-LBD)在结合至不同的配体时的构象的差异（Kiran K. Singarapu et al. 2011Biochemistry 50(51):11015-24)。 维生素 D目前被公认为激素原，其在维持人类的最佳健康中具有多重作用。很早 就已经确定，明显的维生素 D缺乏造成组织学上明显的骨疾病，如成人骨软化症和儿童佝 偻病，而维生素 D不足可以导致甲状旁腺激素浓度的改变，如果持续一段时间，这可能促进 骨损失和断裂。但是，虽然初步确定为钙稳态的经典调节，目前已经维生素 D具有更为广谱 的作用，其通过维生素 D受体（VDR)在人类组合中的广泛表达和分布来驱动。 在过去的几十年里，临床和流行病学数据已提供了一些证据，表明减弱的25(0H) D的水平与各种慢性疾病的风险增加相关联，这些疾病包括心血管疾病、高血压、心肌梗 死、糖尿病、癌症、减少的神经肌肉功能、感染和自身免疫疾病。甚至妊娠并发症如先兆子 痫、妊娠糖尿病、剖宫产、和早产等都可能是妊娠期维生素 D缺乏的悲剧的后遗症（Holick MF ;2007 N Engl J Med. 357(3):266-81, Holick MF 和 Chen TC. 2008Am J Clin Nutr.; 87(4) :1080S-6S) 〇 但是，鲜有进行将慢性病风险关联至1，25(0H)2D水平的研宄，原因在于当前可采 用的测试方法复杂且缺乏可靠性。 因此，在许多不同的临床应用中，作为诊断标志物和/或作为治疗监测指标，作为 维生素 D的活性形式的循环1，25(0H)2D的测定正变得越来越重要。例如，血清1，25(0H)2D 和甲状旁腺激素（PTH)水平以及它们可能的相关性的测定可能代表了一种用于辅助甲状 旁腺疾病的诊断以及用于在肾功能衰竭期间或维生素-D抗性佝偻病（VDRR)的发展中检测 继发性甲状旁腺功能亢进的发病的重要措施。 目前，无论是在常规临床应用还是在研宄应用中，存在广泛的可用 于测量总25 (OH)D (即25 (0H)D3+25 (OH)D2)的循环水平的方法。由Abbott Diagnostics (Abbott Park, IL，USA，ARCHITECT 25-OH维生素 D测定）、01&5〇1^11111。· (Stillwater，MN，USA, LIAISON!、250H 维生素 D 全测定）、Immunodiagnostic Systems (Boldon, England, IDS-iSYS 25-羟基维生素 D (250HD))、Roche Diagnostics ( Mannheim,Germany,Modular Analytics E170 Elecsys? 维生素 D 全测定）和 Siemens Healt本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗体，其特异性地结合至在维生素D受体的配体结合结构域(VDR‑LBD)和1,25‑二羟基维生素D或1,25‑二羟基维生素D的类似物之间形成的复合物的VDR‑LBD而不与未复合的VDR‑LBD交叉反应。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔舒亚·索尔多，格雷戈里·奥尔森，迈克尔·卢特曼，约翰·瓦尔，迈克尔·纽，赫克托耳·弗洛伊德·德卢卡，法布里齐奥·博内利，
申请(专利权)人：索灵股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT
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