用于检测雄激素类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种能同时识别诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙的特异性单克隆抗体,它是由保藏号为CCTCC NO:C201494的杂交瘤细胞株NT4D12所分泌的。本发明专利技术还公开了一种检测雄激素类药物的酶联免疫方法和试剂盒。与现有技术相比，本发明专利技术制备的单克隆抗体可以同时检测诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙四种雄激素类药物，且检测灵敏度高，特异性好。本发明专利技术的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度、准确度高，精密度好。

【技术实现步骤摘要】
用于检测雄激素类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法及试剂盒
本专利技术属于兽药残留分析和免疫学
，具体涉及一种能识别雄激素类药物的单克隆抗体和一种用于检测雄激素类药物残留的酶联免疫方法(ELISA)和试剂盒。
技术介绍
蛋白同化雄激素是一类人工合成的甾体性激素，具有环戊烷多氢菲的基本结构，此类药物在兽医临床上具有重要的作用，能够促进蛋白质的合成和骨骼肌的生长，通过抑制脂肪的增长，从而使肌肉变发达，并且能够刺激动物对食物的欲望，使动物的日增重提高，同时大大提高了饲料的利用效率。若大剂量摄入雄激素会对骨髓的造血功能有刺激作用，尤其是能够促进生成红细胞并能刺激长骨的生长。此类药物通常比较稳定，在动物体内滞留时间长，并且在动物体内残留，人类长期食用含有雄激素及其代谢物的动物性食品会产生头痛、胸闷、心悸、肌肉疼痛等中毒症状，还能导致内分泌失调、痤疮、毛发減少和秃顶等症状，也可引起低蛋白血症，对男性生殖系统造成损伤，除此之外还能造成肝脏、肾脏的病变，甚至能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤。我国于2002年发布的文件中规定在动物性食品中不得检出甲睾酮、群勃龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙等性激素药物。目前关于雄激素类药物的仪器检测方法很多，例如气象色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC),气质联用法(GC-MS)，液质联用法(LC-MS)等。仪器分析方法虽然灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但是需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，对于快速检测雄激素药物更具优势。CN102336830A公开了一种抗诺龙的特异性抗体，它是将17β-NT半抗原与BSA蛋白连接合成免疫原；CN103116031A公开了一种群勃龙残留快速检测试纸卡，它是以群勃龙－牛血清白蛋白偶联物为免疫原，得到的单克隆抗体可识别群勃龙，对诺龙也有一定的交叉反应率。现有的酶联免疫方法和试剂盒只能识别1-2种雄激素类药物，不能同时进行多种药物成分的检测，更加没有能同时检测诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙四种雄激素类药物的酶联免疫试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是：(1)提供一种能同时识别多种雄激素类药物的单克隆抗体；(2)利用该单克隆抗体，制备一种用于多种雄激素类药物检测的酶联免疫试剂盒；(3)利用该试剂盒，建立一种用于多种雄激素类药物非诊断目的检测的ELISA方法；上述目的是通过以下技术方案实现的：一种单克隆抗体，能识别雄激素类药物，所述单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO:C201494的杂交瘤细胞株NT4D12所分泌的。所述雄激素类药物为诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙。所述的杂交瘤细胞株NT4D12，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201494。进一步，本专利技术提供了一种能检测肉类食物中雄激素类药物残留的酶联免疫方法，包括以下步骤：(1)将结构为式(1)所示的化合物(甲睾酮3-对肼基苯甲酸，MT-CPD)与匙孔蓝蛋白(KLH)偶联得到免疫原(MT-CPD-KLH)；(2)用免疫原免疫小鼠获得保藏号为CCTCCNO:C201494的杂交瘤细胞株NT4D12；(3)用保藏号为CCTCCNO:C201494的杂交瘤细胞株NT4D12制备单克隆抗体；(4)将半抗原(MT-CPD)与卵清白蛋白(OVA)偶联得到包被原(MT-CPD-OVA)；(5)用步骤(4)的包被原包被固相载体；(6)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。优选地，所述待测样品的提取方法是：将待测样品用酸化乙腈进行提取，提取液氮气吹干后用PBS缓冲液复溶。本专利技术以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测雄激素类药物的酶联免疫检测试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对雄激素类药物的酶联免疫检测。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术在抗体制备时，采用甲睾酮与对肼基苯甲酸反应生成的化合物甲睾酮3-对肼基苯甲酸作为半抗原，该半抗原体现了雄激素药物的甾体母环结构，由该半抗原制备的单克隆抗体可识别诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙。2、本专利技术制备的单克隆抗体对诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙的识别灵敏度高，IC50分别为3.12μg/L、0.41μg/L、3.48μg/L、8.86μg/L；该抗体对诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙四种药物具有较高的交叉反应率，对其它药物的交叉反应率很低，显示出良好的特异性。3、本专利技术建立的ELISA方法和试剂盒检测灵敏度、准确度高，精密度好。附图说明图1为本专利技术制备的半抗原(甲睾酮3-对肼基苯甲酸)、匙孔蓝蛋白(KLH)、免疫原(甲睾酮3-对肼基苯甲酸-KLH偶联物)的紫外扫描图谱。图2为本专利技术制备的半抗原(甲睾酮3-对肼基苯甲酸)、卵清白蛋白(OVA)、免疫原(甲睾酮3-对肼基苯甲酸-OVA偶联物)的紫外扫描图谱。图3为本专利技术的单克隆抗体与诺龙标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为诺龙标准溶液浓度对数值，Y轴为诺龙标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步说明，但不限制本专利技术。实施例1半抗原的制备半抗原甲睾酮3-对肼基苯甲酸(MT-CPD)的合成：称取60mg甲睾酮溶于10ml甲醇中，加入30mg对肼基苯甲酸，加入适量的Na2CO3，室温下反应，TLC监测反应进程，约2h反应完全。氮气吹干，用稀盐酸将反应液调制酸性，加入乙酸乙酯萃取，收集有机层，氮气吹干得终产物MT-CPD。实施例2免疫原和包被原的制备DCC法合成完全抗原MT-CPD-KLH(OVA):取KLH2ml/10mg或OVA20mg溶于15mLPBS中，为A液。称取MT-CPD25mg溶于200μLN,N-二甲基甲酰胺中，为B液。分别称取18mgDCC和12mgNHS溶于200μLN,N-二甲基甲酰胺中为C液。室温条件下，将B液与C液混合反应12h为D液。将D液缓慢滴入A液中，冰浴反应过夜。反应过程如下：将上清液在4℃下用PBS透析7d，每天更换2次透析液，除去未反应的小分子物质。将MT-CPD-KLH或MT-CPD-OVA溶液冻干，于-20℃冰箱保存，分别为免疫原和包被原。实施例3单克隆抗体的制备3.1动物免疫参照杨汉春《动物免疫学》，利用专利技术人制备的MT-CPD-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)，免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束后休整1月)腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。3.2细胞融合和克隆化融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1～2×107个SP2/0与108个免疫脾细胞(1:10～1:15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能识别雄激素类药物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201494的杂交瘤细胞株NT4D12所分泌的，所述雄激素类药物为诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙。

【技术特征摘要】
1.一种能识别雄激素类药物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCNO:C201494的杂交瘤细胞株NT4D12所分泌的，所述雄激素类药物为诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙。2.一株杂交瘤细胞株NT4D12，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201494，所述杂交瘤细胞株NT4D12分泌的单克隆抗体能识别雄激素类药物，所述雄激素类药物为诺龙、甲睾酮、睾酮、群勃龙。3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测雄激素类药物的酶联免疫试剂盒中的应用。4.包含权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒。5.根据权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测雄激素类药物的酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁宗辉，王惠，彭大鹏，潘源虎，王玉莲，陈冬梅，冯亮，朱永利，刘振利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42