本发明专利技术公开了一种抗血管内皮生长因子的单链抗体及其与铁调素蛋白相融合的蛋白质，所述单链抗体具有高度特异性的抗原识别能力，所述融合蛋白既具有抗体的特异性识别作用，同时又具有优异的抗肿瘤效果，其对三种不同类型的肺癌细胞系均有明显的生长抑制作用，在动物实验中均可以使小鼠肺肿瘤组织较对照组有明显减小，而且该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。
An anti vascular endothelial growth factor antibody and fusion protein with fertin
The invention discloses a single chain antibody against vascular endothelial growth factor fusion and hepcidin protein, antigen recognition ability has high specificity of the scFv, specific recognition of the fusion protein with both antibodies, but also has excellent antitumor effect, on the three lung cancer cell lines of different types have obvious inhibitory effect, in animal experiments can make mouse lung tumor tissue compared with the control group decreased significantly, and the antibody fusion protein molecular weight is small, can be expressed in prokaryotic cell expression system, greatly reduces the cost of production of antibody drugs.
【技术实现步骤摘要】
一种抗血管内皮生长因子抗体及与铁调素的融合蛋白
本专利技术公开了一种单链抗体及与铁调素的融合蛋白，属于免疫学和分子生物学领域。
技术介绍
肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。肿瘤的形成和发展具有非常复杂的调节机制，有非常多的生物效应分子参与其中，明晰这些生物效应分子的作用机制，对于肿瘤疾病的预防和治疗具有重要的意义。现有技术业已发现血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)和铁调素均不同程度地涉及了肿瘤的形成和发展进程的调控。VEGF，早期亦称作血管通透因子(VascularPermeabilityFactor，VPF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(Heparin-BindingGrowthFactor)，可在体内诱导血管新生。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，两条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。VEGF分解的单体无活性,去除N2糖基对生物效应无影响,但可能在细胞分泌中起作用。由于mRNA不同的剪切方式，产生出VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206等至少5种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。2004年2月26日，第一个通过抑制VEGF作用机制的肿瘤治疗药物阿瓦斯汀获得FDA的批准，其是针对VEGF的人源化单克隆抗体。铁(Fe)是体内含量最丰富的微量金属元素，也是人体生命能量转化的关键酶---血红素酶复合体中起电子传递作用的金属元素。此外，其在人体中分布很广，几乎所有的组织都含有铁，与健康有着密切的关系。铁离子具有调节细胞微环境的功能，铁离子降低会导致贫血，铁离子升高会引发细胞的氧化应激反应，导致细胞功能障碍或死亡。铁调素(GH)在调节细胞内外铁离子平衡中起到重要的作用。研究发现，肝癌细胞内铁离子浓度低，和周围正常组织以及正常肝细胞相比，肝癌细胞内铁调节基因表达下降，肿瘤细胞表面转铁蛋白受体表达量增高，使得肿瘤细胞内的铁离子向细胞外流出，肿瘤细胞处于一种低水平铁离子耐受状态。尽管现有技术已经发现了VEGF和铁调素在肿瘤调控中的重要角色，但是目前还缺乏将其应用于肿瘤治疗和预防药物的具体技术手段，这也是在肿瘤药物制备领域一个需要解决的技术问题。传统的治疗肿瘤的方法是手术或者放、化疗。随着近年生物制药技术的发展，一批优质的抗肿瘤抗体药物的问世，使得一些难治性肿瘤的生存率大大提高。抗体药物已作为肿瘤患者常规的治疗药物之一，预计2020年，单抗药物的销售额将达到2000亿美元。自从1984年第一个基因工程抗体人－鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体(Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等)、多价小分子抗体(双链抗体，三链抗体，微型抗体)、某些特殊类型抗体(双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体)及抗体融合蛋白(免疫毒素、免疫粘连素)等等。另外，用于制备新型抗体的噬菌体抗体库技术成为继杂交瘤技术之后生命科学研究中又一突破性进展。对于血液性肿瘤，全分子抗体药物具有一定的技术优势，它们可以激活补体和免疫细胞将血液中游走的肿瘤细胞杀死。但是对于实体肿瘤，由于全分子抗体药物分子量大，进入不到实体瘤内部，它们的抗肿瘤效果不甚理想，而小分子抗体却可以轻松进入实体瘤内部发挥抗肿瘤作用。未来的抗体药物将以小分子抗体药物为主。小分子抗体药物尤其对中国来说更为必须，因为在中国多发的肺癌、肝癌和消化道系统肿瘤中绝大多数都是实体性肿瘤。中国男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。而在肺癌中也有些是死亡率非常高的转移性肿瘤，如肺癌的脑转移发生率可以达到35％～50％，多个部位的骨转移发生率可以达到50％。对于脑和骨转移的癌症治疗，小分子抗体药物就可以发挥其无法替代的抑制转移作用。目前小分子抗体开发成药物主要以两种形式为主，一种是抗体偶联复合物(AntibodyConjugateComplex，ADC)。抗体-药物偶联物是一种新型的靶向治疗，比如抗肿瘤治疗中，ADCs由一个抗体或一个抗体片段ScFv连接着一个有效载荷的药物(通常是毒素)形成一个免疫复合物。抗体使这个免疫复合物结合到特定的肿瘤细胞上，通常这个免疫复合物会内化到肿瘤细胞内部，然后药物释放到细胞内引起肿瘤细胞损伤和死亡。抗体偶联复合物虽然具有很好的肿瘤识别能力和抗瘤效应，但是其制备过程中需要与另外的化学基团偶联，不仅增加了制备成本，还难以保证产物的均一性，偶联的化学基团与抗体的抗原识别区往往还容易产生空间位阻效应，有时对机体还具有毒副作用，这些因素都影响抗体偶联复合物实际的抗瘤效果。小分子抗体片段的另外一个形式是双特异抗体。双特异性抗体(BsAbs)就是可以识别两个不同表位的抗体。相比正常抗体，BsAbs在癌症治疗中有一些无法比拟的优势：1.BsAbs可增强特异性免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用。2.BsAbs可以同时作用于两种不同的通路，发挥独特或加倍的抗肿瘤作用。3.BsAbs可识别靶细胞表面两个抗原表位，增强结合能力。双特异抗体尽管具有很好的肿瘤识别能力，但是往往还需要借助其它的调节蛋白或细胞来促进机体产生抗瘤效应，因此难以保证高效的协同效应，其抗瘤效果仍然难以达到令人满意的效果。
技术实现思路
基于现有技术存在的问题，本专利技术的目的是研发出一种具有特异性识别能力的抗血管内皮生长因子的单链抗体，进而提供一种介于上述两种新型抗体药物之间的具有增强的抗肿瘤作用的抗体融合蛋白。基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种抗血管内皮生长因子的单链抗体，所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接肽相连。在一个最为优选的技术方案中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。其次，本专利技术还提供了一种含有上述单链抗体的融合蛋白。在一个优选的技术方案中，所述融合蛋白还含有氨基酸序列如SEQIDNO.10所示的铁调素蛋白。在一个更为优选的技术方案中，在所述抗体和所述铁调素蛋白之间以连接肽相连。在一个又为优选的技术方案中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。在一个最为优选的技术方案中，所述铁调素蛋白位于融合蛋白的氨基端。最后，本专利技术提供了上述融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术选取具有确定性抗肿瘤作用的靶点血管内皮生长因子本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗血管内皮生长因子的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗血管内皮生长因子的单链抗体，其特征在于，所述抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接肽相连。4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列如...
【专利技术属性】
技术研发人员：满来，谢珞琨，李峥，
申请(专利权)人：北京格根生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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