本发明专利技术公开了一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白，所述融合蛋白由抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体组成，其具有能够分别识别VEGF和EGFR的两组独特的CDR区序列，对VEGF和EGFR具有高度特异的识别能力，且具有优异的肿瘤结合效果和肿瘤定位效应。本发明专利技术还公开了偶联了指示剂的所述双特异抗体融合蛋白在制备体外肿瘤诊断试剂和体内生物成像剂中的应用。偶联上核磁和荧光显像剂的双特异抗体融合蛋白，可以在体内进行肿瘤成像。而且该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。
【技术实现步骤摘要】
一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白及其应用
本专利技术公开了一种抗体蛋白，更具体地，本专利技术公开了一种双特异抗体融合蛋白。
技术介绍
肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。肿瘤的临床诊断技术也在逐渐提高。从最初的肿瘤标记物的检测、超声、透视等手段，发展到现在更多的肿瘤相关因子的蛋白水平和分子水平的检测、CT、核磁、PET、SPET，以及肿瘤微创的活检等等技术都已在临床上广泛应用。肿瘤的诊断分为体外和体内诊断。在体外，肿瘤组织的免疫组织化学染色是确诊肿瘤的一个重要指标。体内诊断，一般是利用一些显像剂再辅助一些仪器进行肿瘤成像。肿瘤体内成像不仅能够早期诊断肿瘤，而且能够实时监测抗肿瘤治疗的效果以及肿瘤的进展情况。因为它是无创检查，给病人带来的痛苦小，已经成为临床确诊和治疗肿瘤的必不可少的诊断手段。目前医院常用的肿瘤体内显像使用的是放射性核素显像，以及核磁。近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。近红外荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点，其光谱范围为700-1000nm，在此波段范围内被监测的生物体与组织的自发荧光干扰较小，穿透组织距离可高达数厘米，提高了成像的准确度和灵敏度。随着肿瘤靶点不断增多，利用特异性针对肿瘤靶抗原的抗体作为指示剂的研究也在逐渐深入。但是传统的全分子抗体分子量较大，并不能很快分布到全身，也不能很好地结合一些被遮蔽的靶位，所以抗体作为指示剂的可行性大打折扣。但是基因工程技术创造出了仅有抗原结合功能的分子量小的抗体片段，使得这一设想得以实现。如果将特异性针对肿瘤靶点的抗体偶联上顺磁性阳性造影剂和近红外荧光染料，这样可以同时适用两种临床诊断手段，一种通过核磁，另一种通过激光激发。不仅增加了核磁的确诊率，而且通过激光激发出的红色荧光还可以应用到手术导航中，为临床肿瘤的确诊提供了一个新的方法，而且也为手术切除肿瘤提供了一个助判手段。用来确诊肿瘤的靶点通常都是细胞表面蛋白。血管内皮生长因子(VEGF)也可以作为一个肿瘤诊断的靶标，VEGF是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。通过阻断EGFR与其配体的结合可以抑制EGFR向胞内的信号传导，从而起到抑制肿瘤细胞生长、迁移的效果。在一篇研究中，科学家利用特异性针对前列腺特异性膜抗原的纳米抗体制备了显像剂用于前列腺癌的SPECT/CT显像。(ANovel111In-LabeledAnti–Prostate-SpecificMembraneAntigenNanobodyforTargetedSPECT/CTImagingofProstateCancer.JNuclMed2015；56:1094–1099.)。另一篇研究中，科学家将两个鼠源Fab抗体片段通过点化学的方法连接起来，再连上铜64用来肿瘤显像，效果也很好。(Noninvasivebraincancerimagingwithabispecificantibodyfragment,generatedviaclickchemistry.PNAS,2015(112):12806–12811.)。刚刚发表的一篇研究中(SarahM.Chealetal,CurativeMulticycleRadioimmunotherapyMonitoredbyQuantitativeSPECT/CT-BasedTheranostics,UsingBispecificAntibodyPretargetingStrategyinColorectalCancer,JournalofNuclearMedicine(2017).DOI:10.2967/jnumed.117.193250)，纽约纪念斯隆凯特林癌症中心和波士顿麻省理工学院的研究人员开发了一个新的三步系统，使用核医学来瞄准和消除结直肠癌。在这项使用小鼠模型的研究中，研究人员达到了100％的治愈率-没有任何治疗相关的毒性作用。这项研究报告在“核医学杂志”2017年11月份的专题文章中出现。在这项研究中，在95％以上的原发和转移性人结直肠癌中发现抗原糖蛋白A33(GPA33)。用抗A33肿瘤抗原的双特异性抗体和用于小分子放射性半抗原的二抗177(177Lu)和S-2-(4-氨基苄基)1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸(177Lu-DOTA-Bn)，应用DOTA预靶向放射免疫疗法(PRIT)策略在小鼠模型上进行测试。所有经DOTA-PRIT处理的动物均耐受良好的治疗，并且所有9只评估的小鼠在显微镜检查时均没有剩余的癌症痕迹。对重要器官，包括骨髓和肾脏也没有可检测的辐射损伤。在小鼠模型中100％治愈率是一个有希望的初步发现，表明抗GPA33-DOTA-PRIT将是人类GPA33阳性结直肠癌肿瘤的有效放射免疫治疗方案。如果临床上取得成功，使用更多的针对人类肿瘤抗原的精细抗体就可以应用于所有固体和液体肿瘤。在肿瘤学方面，尤其是对于实体瘤，对于晚期疾病的治愈性治疗存在巨大的需求，包括结肠癌，乳腺癌，胰腺癌，黑色素瘤，肺癌和食管癌等等。随着现有技术的不断发展，基于抗体特异性识别功能的肿瘤成像和治疗需求日益扩大，然而，现有技术中的抗体也因为特异性不高导致肿瘤结合效果欠佳，靶点单一以至于存在漏检风险，偶联剂标记单一造成检测成本增高，以及抗体与指示剂的偶联适应度不高限制成像效果等问题而限制了上述技术的进一步应用。
技术实现思路
基于现有技术存在的问题，本专利技术的目的是研发出一种具有双重识别功能的特异性单链抗体融合蛋白，将两种特异性的单链抗体用分子生物学技术串联在一起，利用其抗表皮生长因子受体一端识别肿瘤细胞，另一端利用抗血管内皮生长因子单链抗体识别肿瘤组织局部的血管内皮生长因子，进而提供一种介于上述两种新型抗体药物之间的具有增强了的肿瘤识别作用的双特异抗体。同时也提供了一种具有双重体内显像效果的生物大分子偶联物及其应用。基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白，所述融合蛋白由抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体组成，所述VEGF单链抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗VEGF单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示；所述抗EGFR单链抗体的轻链CDR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白，所述融合蛋白由抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体组成，其特征在于，所述VEGF单链抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗VEGF单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示；所述抗EGFR单链抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11和12所示，所述抗EGFR单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白，所述融合蛋白由抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体组成，其特征在于，所述VEGF单链抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗VEGF单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示；所述抗EGFR单链抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.10、11和12所示，所述抗EGFR单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.14、15和16所示。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特在在于，所述抗VEGF单链抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示，所述抗EGFR单链抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.13和17所示。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗VEGF单链...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢珞琨，满来，李峥，许春萍，
申请(专利权)人：北京格根生物科技有限公司，亦康北京医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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