一种抗Engrailed-2蛋白单克隆抗体37C3制造技术

本发明专利技术公开了一种抗Engrailed

【技术实现步骤摘要】
一种抗Engrailed
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2蛋白单克隆抗体37C3
[0001]本专利技术专利申请是申请日为2019年12月10日，申请号为CN 201911260733.8的中国专利技术专利申请“一种抗Engrailed
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2蛋白单克隆抗体及其应用”的分案申请。


[0002]本专利技术公开了一种单克隆抗体，属于多肽


技术介绍

[0003]Engrailed
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2蛋白是由EN2 基因编码的一段含有331个氨基酸的同源盒蛋白，其生物学功能是作为转录因子与特定的 DNA 结合，从而在转录水平上起调节作用。绝大部分EN
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2蛋白作为转录因子定位于核内，但是也发现有一少部分(<5％)EN
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2蛋白位于胞质内，能被细胞分泌和摄取，并参与调节转录和翻译。
[0004]Engrailed
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2基因属于同源盒基因家族，其在进化中高度保守，主要在转录水平起调控作用。研究发现，En2基因在多种人类肿瘤中异常表达，在细胞的分化、增殖、凋亡中均发挥重要作用。近年来的研究发现，En2基因的异常表达与恶性肿瘤密切相关。
[0005]2018年，美国癌症协会公布了一份全世界癌症发生与死亡率的报告，报告指出全球癌症发生率前三的分别是肺癌、乳腺癌、和前列腺癌。在男性中，肺癌和前列腺癌是死亡率最高的两种癌症类型。此外，前列腺癌在全球105个国家都是发生率最高的类型，包括北美、南美、西欧和非洲大部分地区，可以算得上是席卷半个世界的癌症类型了。为此，研制出一种针对前列腺癌的诊断和治疗手段已经刻不容缓。
[0006]近年来，随着人口老龄化的发展和饮食结构改变等因素的变化，前列腺癌在中国的发病率也呈逐年上升趋势，已成为最常见的泌尿系肿瘤。我国前列腺癌患者的特点为发现就诊时大多已处于疾病中后期。故而对前列腺癌患者进行早期筛查，能够大幅提高疾病检出率，提高患者的生存期。而前列腺癌目前的标准检测试验PSA 对前列腺癌诊断的敏感性仅为24％，而通过与血液或者尿液中Engrailed
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2蛋白含量结合检查，可大幅提高前列腺癌的诊断敏感性，且能减少非必要的早期侵入性检查。
[0007]本专利技术的目的就是提供一种针对EN
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2蛋白的特异性强、纯度高的单克隆抗体，并将其用于非诊断目的的人EN
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2蛋白的早期检测。

技术实现思路

[0008]基于上述目的，本专利技术首先提供了一种抗Engrailed
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2蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5的第24
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34位、50
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56位、92
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98位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7的第26
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35位、50
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66位、99
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111位氨基酸序列所示。
[0009]在一个优选的实施方案中，所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，在本专利技术中一个优选的的单克隆抗体被命名为37C3。
[0010]在一个更为优选的实施方案中，所述单克隆抗体轻链恒定区的氨基酸序列均如SEQ ID NO.9所示，所述单克隆抗体重链恒定区的氨基酸序列均如SEQ ID NO.11所示。
[0011]第二，本专利技术还提供了一种编码上述的单克隆抗体的多核苷酸，编码所述单克隆抗体轻链可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述单克隆抗体重链可变区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.8所示。
[0012]在一个优选的实施方案中，编码所述单克隆抗体轻链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.10所示，编码所述单克隆抗体重链恒定区的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.12所示。
[0013]最后，本专利技术提供了上述单克隆抗体在制备非诊断目的的人前列腺癌检测试剂中的应用。
[0014]在一个优选的实施方案中，所述应用为免疫组化检测方法。
[0015]在另一个优选的实施方案中，所述应用为胶体金检测方法。
[0016]本专利技术通过人工构建Engrailed
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2基因，并将其导入原核细胞——大肠杆菌中，表达Engrailed
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2蛋白，并将其纯化。后使用该蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体，最终筛选出37C3杂交瘤细胞株，并得到杂交瘤细胞对应的单克隆抗体。这些抗体可以与Engrailed
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2蛋白特异性结合，且能与前列腺癌癌患者尿液中的Engrailed
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2蛋白特异性结合。所述抗体在人前列腺癌的特异性诊断中具有重要的应用价值。因此本专利技术还提供了所述抗体在制备诊断人前列腺癌检测试剂中的应用。所述的单克隆抗体能够降低免疫反应的交叉反应性，适用于人前列腺癌的早期筛查和诊断。
附图说明
[0017]图1. EN2 C端114aa蛋白SDS
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PAGE鉴定图谱；图2. EN2 C端114aa蛋白的WB鉴定图谱；图3. 293T转染EN2
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RFP融合蛋白后SDS
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PAGE鉴定图谱；图4 .Western
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blotting 检测293T 转染EN2
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RFP融合蛋白图谱；图5. 三种前列腺癌细胞系（LNCap，DU145，PC3）总蛋白的EN2单抗检测结果图；图6 .EN2单抗的免疫荧光检测图；图7.外源性和内源性EN2蛋白在三种前列腺癌细胞系的亚细胞定位图；图8.前列腺增生和癌症的代表性的EN2免疫组化图；图9 .胶体金法检测前列腺癌病人尿液中EN2的结果图。
具体实施方式
[0018]下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的保护范围构成任何限制，本专利技术的保护范围以权利要求书为准。
[0019]通过NCBI (National Center for Biotechnology Information）查得engrailed homeobox 2基因（NM_001427.3），选择C末端114aa片段用来制备EN2单克隆抗体。通过DNA自动合成仪合成该段基因。在获得这些靶序列之后,将其连接于基因表达载体pET
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28a的Nhe I与Xho I之间，并将其转化到大肠杆菌中。在适当的条件下诱导大肠杆菌表达目的片段，经
过蛋白的回收和纯化，就获得了重组的Engrailed
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2蛋白。
[0020]在获得高纯度的Engrailed
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2目的蛋白之后，采本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗Engrailed
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2蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5的第24
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34位、50
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56位、92
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98位氨基酸序列所示，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7的第26
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35位、50
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66位、99
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111位氨基酸序列所示。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链恒定...

【专利技术属性】
技术研发人员：萨日赅，李峥，满来，
申请(专利权)人：北京格根生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：