一种全人源抗EGFR单链抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种全人源抗EGFR单链抗体，所述单链抗体具有独特的CDR区，对抗原具有高度特异性的识别能力。所述单链抗体具有优异的肿瘤结合效果，对不同类型的肿癌细胞系均有特异性结合。本发明专利技术还公开了偶联了指示剂的所述抗体在制备体外肿瘤诊断试剂和体内生物成像剂中的应用，当所述成像剂应用在肿瘤动物模型上，标记了近红外荧光的所述单链抗体可以清楚地显示出小鼠肿瘤的大小和位置，具有极高的体内成像能力。

An all human anti EGFR single chain antibody and its application

The invention discloses a whole human anti EGFR single chain antibody, which has a unique CDR region and is highly specific to the original. The scFv has excellent tumor binding effect and has specific binding to different types of swollen cancer cell lines. The invention also discloses the application of the antibody of the indicant to the preparation of an in vitro tumor diagnosis reagent and in vivo bioimaging agent. When the imaging agent is applied to the tumor animal model, the single chain antibody labeled the near infrared fluorescence can clearly show the size and location of the mouse swollen tumor and has a very high body. Internal imaging capability.

【技术实现步骤摘要】
一种全人源抗EGFR单链抗体及其应用
本专利技术涉及一种抗体，更为具体地，本专利技术涉及一种单链抗体。
技术介绍
肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。肿瘤的临床诊断技术也在逐渐提高。从最初的肿瘤标记物的检测、超声、透视等手段，发展到现在更多的肿瘤相关因子的蛋白水平和分子水平的检测、CT、核磁、PET、SPET，以及肿瘤微创的活检等等技术都已在临床上广泛应用。表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。通过阻断EGFR与其配体的结合可以抑制EGFR向胞内的信号传导，从而起到抑制肿瘤细胞生长、迁移的效果。基于EGFR在人类肿瘤发生中失去控制的过度表达的特性，其作为肿瘤发生标志物的角色越来越受到肿瘤诊断领域的关注。肿瘤的诊断分为体外和体内诊断。在体外，肿瘤组织的免疫组织化学染色是确诊肿瘤的一个重要指标。体内诊断，一般是利用一些显像剂再辅助一些仪器进行肿瘤成像。肿瘤体内成像不仅能够早期诊断肿瘤，而且能够实时监测抗肿瘤治疗的效果以及肿瘤的进展情况。由于其是无创检查，给病人带来的痛苦小，已经成为临床确诊和治疗肿瘤的必不可少的诊断手段。目前医院常用的肿瘤体内显像使用的是放射性核素显像，以及核磁。近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。近红外荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点，其光谱范围为700-1000nm，在此波段范围内被监测的生物体与组织的自发荧光干扰较小，穿透组织距离可高达数厘米，提高了成像的准确度和灵敏度。随着肿瘤靶点不断增多，利用特异性针对肿瘤靶抗原的抗体作为指示剂的研究也在逐渐深入。但是目前的全分子抗体分子量较大，并不能很快分布到全身，也不能很好地结合一些被遮蔽的靶位，所以抗体作为指示剂的可行性大打折扣。即使基因工程技术创造出了仅有抗原结合功能的分子量小的抗体片段，使得这一设想得以实现，但是现有技术中的抗体也因为特异性不高，以及抗体与指示剂的偶联适应度不高等问题而限制了这一诊断手段的进一步应用。
技术实现思路
基于现有技术存在的问题，本专利技术的目的是研发出一种具有特异性识别能力的抗内皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体，进而提供一种既能作为体外诊断试剂，又能作为体内成像剂的检测抗体。基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了全人源抗EGFR单链抗体，所述抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。在一个最为优选的技术方案中，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。其次，本专利技术提供了一种生物大分子偶联物，所述偶联物含有上述任一抗体。在一个优选的技术方案中，在所述偶联物中，近红外荧光蛋白或者辣根过氧化物酶与所述抗体偶联。最后，本专利技术提供了上述偶联物在制备肿瘤诊断制剂中的应用。在一个优选的技术方案中，所述近红外荧光蛋白与所述抗体偶联，所述偶联物被制备为免疫荧光诊断试剂。在另一个优选的技术方案中，所述辣根过氧化物酶与所述抗体偶联，所述偶联物被制备为免疫组化诊断试剂。在又一个优选的技术方案中，所述近红外荧光蛋白与所述抗体偶联，所述偶联物被制备为体内荧光成像剂。本专利技术利用噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗EGFR的ScFv，然后使用辣根过氧化物酶或近红外荧光标记偶联，分别作为体外免疫荧光诊断、免疫组化诊断抗体和体内荧光显像剂。本专利技术提供的抗EGFR单链抗体能够特异性结合肿瘤组织中的EGFR蛋白，其具有优异的亲和力，亲和力常数为5.37×10-10M。而大多数自身抗体的亲和力常数小于10-5--8M，因此本专利技术的抗EGFR单链抗体能够在用于体内诊断显像时可以竞争自身抗体与EGFR表面抗原结合，在经过与适宜的指示剂偶联后可以对肿瘤细胞和组织进行染色和显像，显示了本专利技术的抗EGFR单链抗体在制备体内和体外诊断试剂应用上的良好前景。由于本专利技术选用的是抗体小分子片段，该单链抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，因此能够极大地降低抗体药物的生产成本。由于本专利技术提供的单链抗体来源于人源的噬菌体抗体库，因此其序列是全人源的，这就保证了该抗体在人体内作为治疗药物或者体内成像诊断试剂的使用具有非常低的免疫原性。附图说明图1.VH和VLPCR产物鉴定图；图2.载体图谱和重组载体鉴定图；图3.筛选出的EGFRScFv与EGFR蛋白的结合试验柱状比较图；图4.纯化后的EGFRScFv聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图；图5.EGF阻断EGFRScFv与EGFR蛋白的结合试验曲线图；图6A.近红外荧光标记的EGFRScFv对结肠癌肿瘤细胞HT29的免疫荧光结果显示图；图6B.经无荧光标记的EGFRScFv阻断的免疫荧光结果显示图；图7.辣根过氧化物酶标记的EGFRScFv对小鼠结肠癌肝转移组织化学显色光镜显示图；图8.近红外荧光标记的EGFRScFv对小鼠胰腺癌原位瘤的体内成像图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的保护范围构成任何限制。实施例1抗EGFR单链抗体的制备1.1高库容量天然抗体库的建立。分离人外周血单个核淋巴细胞：随机选取100个健康成年人，抽取每人外周血10ml。用含10％肝素的RPMI-1640培养液1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2,000×g，离心17分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，PBS缓冲液洗两次。1.2细胞总RNA的提取按每5×106cells/ml的比例加入Trizol试剂，吹打细胞使之裂解。室温孵育5分钟，移入经DEPC处理的EP管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟。4℃，10,000×g离心15分钟，吸取上层水相至一个新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，冰浴10分钟。4℃，12,000×g离心10分钟，弃上清，加入1ml75％乙醇清洗沉淀。4℃，7,500×g离心5分钟，弃上清，室温干燥沉淀，溶于无RNase的水或沉淀于无水乙醇内，-80℃保存备用。1.3逆转录合成cDNA第一链先用无RNase的DNaseⅠ处理总RNA以消除残存的基因组DNA。取处理过的RNA样品2μg和Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，补加DEPC水至12μl，70℃，加热10分钟。取出后马上置于冰浴中，依次加入5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全人源抗EGFR单链抗体，其特征在于，所述抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。

【技术特征摘要】
1.一种全人源抗EGFR单链抗体，其特征在于，所述抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示，所述抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.5、6和7所示。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和8所示。3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述连接多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。5.一种生物大分子偶...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢珞琨，满来，李峥，许春萍，
申请(专利权)人：北京格根生物科技有限公司，亦康北京医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11