特异结合乏氧肝癌单抗H103轻、重链可变区基因及其应用制造技术

特异结合乏氧肝癌单抗H103轻、重链可变区基因及其应用，本发明专利技术涉及特异结合人肝癌乏氧表型的单克隆抗体H103的重链和轻链可变区基因和由所述基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧肝脏肿瘤药物中的应用。本发明专利技术人采用常氧阴性扣除筛选结合乏氧阳性选择的差异淘筛技术，成功地从自建的人噬菌体单链抗体库中克隆了特异结合乏氧肝癌细胞的H103抗体轻、重链可变区基因。所得重链和轻链可变区基因可编码正确的全人源抗体可变区。基于上述已克隆到的肝癌乏氧特异结合人源单克隆抗体H103轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便用于乏氧表型肝脏肿瘤的精准诊断和靶向治疗目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗体H103重链和轻链可变区基因和由所述基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于乏氧肝脏肿瘤诊断和靶向治疗中的应用。
技术介绍
肝癌是我国和东南亚地区的多发病和常见病。尤其在我国，每年约有13万人死于此病，约占全世界每年肝癌总死亡人数的42％。近年来，肝癌在我国的发病率还有逐渐增高的趋势。肝癌具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、侵袭性强、易复发转移、预后差等特点，肝癌的早期诊断和临床治疗疗效均不是十分理想。肿瘤休眠细胞激活是导致肝癌复发和转移的主要根源。肿瘤休眠现象在临床上非常普遍，许多休眠的原发癌或转移癌灶常常表现为癌组织或细胞不同程度的乏氧特点。对于肝癌患者而言，许多人在原发肝癌切除几个月甚至几周内，整个肝脏、肺或骨骼多处出现微/小转移灶。这种休眠的肿瘤细胞被激活后快速增殖，从而导致复发和转移、病情迅速恶化。因此，临床处理原发肝癌时，不应只考虑传统的诊断和治疗方案，还要从癌细胞乏氧的特点考虑对微/小转移灶休眠肝癌细胞的精准检测和靶向治疗。问题的关键在于，肿瘤休眠细胞是一群数量极少且难以检测的静止细胞，迄今为止，国内外尚缺乏一种特异的细胞表面标志分子可以将肿瘤休眠细胞与快速增殖的肿瘤细胞或正常组织细胞分离开。由于肿瘤休眠细胞常常位于癌巢乏氧微环境中，肿瘤乏氧生物标志物的发现可定性并定量地反映体内肿瘤休眠细胞实际存在情况，但其发现常常依赖于其特异性结合抗体的先导制备。因此，本专利技术通过细胞常氧培养扣除筛选，结合乏氧培养正向筛选，从噬菌体抗体库中制备可特异结合肝癌乏氧休眠细胞的特异性抗体。利用本项目制备的乏氧特异性抗体，不但可以解析肝癌休眠细胞表面特异性的分子标志，还可进一步结合其它临床常规检测手段，实现精准预测肝癌微/小转移、判断预后生存、评估临床治疗(如免疫治疗)效果及诊断微小残留病变(MRD)；另外，也可望为今后开展精准靶向肝癌休眠细胞的防复发转移治疗提供有力工具。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种乏氧特异结合的单克隆抗体H103的重链和轻链可变区基因，以便两者重组后可表达出特异性识别和结合乏氧肝癌细胞的抗体活性片段。本专利技术的另一目的在于所述基因和多肽在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧肝脏肿瘤药物中的应用。本专利技术的另一目的在于所述基因和多肽在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧肝脏肿瘤药物中的应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术涉及一种特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗体H103重链和轻链可变区基因(序列已提交GeneBank，序列号：KP347981.1)。本专利技术的肝癌乏氧特异结合抗体H103重链和轻链可变区基因是从自己构建的全人源噬菌体抗体库中克隆的。其中所述的重链可变区基因全长为399bp，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>3所示。所述的轻链可变区基因全长为366bp，其核苷酸序列如序列表中<400>2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合乏氧肝脏肿瘤细胞的抗体活性片段。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还涉及所述基因和多肽在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧肝脏肿瘤药物中的应用。本专利技术人收集提取了9例原发性肝癌患者PMBC，利用自行设计引物队列成功扩增出全套人抗体VH和VL可变区基因并组装成scFv抗体基因库。经过6批次电转，建立起一个人源性免疫噬菌体单链抗体库，库容为2×107，随机克隆质粒酶切表明其scFv基因正确插入率为70％，随机克隆测序表明原始库中scFv抗体VH和VL对应同源胚系基因多样性较好；对所建的原始抗体库挽救后的滴度最高可达6×1010pfu L-1，His-tag Western表明其具有较好的scFv抗体呈现表达能力。挽救后噬菌体呈现抗体库经过4轮常氧阴性扣除筛选结合乏氧阳性选择的差异淘筛后，阳性克隆乏氧肝癌细胞的结合富集率增加了约460倍，scFv插入率最后一轮增加到98％。流式细胞术筛查最终确定能与HCCLM3细胞(高转移潜能肝癌细胞株)乏氧结合的阳性候选克隆有7个。其中，H103克隆株呈现最强阳性结合。H103克隆株基因的HB2151菌表达产物经SDS-PAGE电泳表明，诱导的周质腔产物主要含27kD蛋白条带，占总蛋白60％。Western blot分析证实该条带为带有His-tag标签的单链抗体。H103抗体克隆表达产物经HPLC纯化后，目标抗体浓度为0.16mg/mL。流式细胞术免疫荧光检测表明H103单链抗体可与乏氧培养的肝癌细胞HCCLM3等多种细胞株强阳性特异结合，而与常氧培养肝癌细胞及非瘤细胞仅有痕量微弱结合。免疫组化对肝癌组织染色表明，H103单链抗体特异性地结合在肝癌组织的乏氧癌巢区，且其结合分布主要在微血管匮乏的瘤组织处。基于上述已克隆到的特异结合乏氧人肝癌细胞的单克隆抗体H103轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便用于肝癌乏氧的精准诊断和靶向治疗目的。附图说明图1为从噬菌体抗体库中利用常氧阴性扣除筛选结合乏氧阳性选择的差异淘筛原理示意。图2为鉴定自建的人源单链抗体噬菌体呈现库。其中，A为利用测序引物PCR扩增库中随机克隆的琼脂粮电流结果，B为IMGT人IG胚系基因在线序列比对分析所构建抗体库的轻、重链可变区基因多样性。图3为对所筛选的H103单链抗体的表达、纯化和乏氧结合特性鉴定。其中，A为考马斯亮兰染色H103单链抗体在BL21(DE3)菌中原核表达产物及其亲和母纯化的结果，B为流式细胞术分析比较H103单链抗体在不同肝癌细胞株上的常氧和乏氧结合指数。图4为激光共聚焦分析H103单链抗体对肝癌细胞的乏氧结合特异性。图5为H103单链抗体在不同类型肝癌组织上免疫组化染色分析。其中，A为同型对照单链抗体E4B7S在正常肝组织上染色，B、C、D、E、F依次为H103单链抗体在正常肝组织、低分化、高分化、中分化及中分化周围非瘤组织染色结果。图6为H103单链抗体在肝癌组织不同血管分布区域的免疫组化染色分析。A和B为低分化、C和D为中分化、E和F高分化；A、C和E为微血管丰富区，B、D和F为无微血管区。图7为乏氧特异结合单链抗体H103轻链可变区基因的测序图谱。图8为乏氧特异结合单链抗体H103重链可变区基因的测序图谱。具体实施方式抗人肝癌乏氧特异结合单抗H103轻、重链可变区基因的筛选与克隆。所用人单链抗体库为南开大学医学院张思河实验室采用传统的建库方法建立的一个抗体多样性好，库容量高的全人源免疫型噬菌体抗体库，库中所含抗体分子亚型主要为IgG和IgM。大容量人源scFv抗体库构建：用淋巴细胞分离液提取原发性肝癌患者(未行外科手术切除或移植免疫抑制)新鲜外周血PMBC，Trizol裂解细胞，氯仿-异丙醇-无水乙醇法提取总RNA。以反转录的cDNA为模板，设计合成人IgG抗体胚系可变区基因全套引物并引入Sfi I、Not I酶切位点，PCR扩增人IgG VH、VL基因库。酶切并凝胶纯化后与(Gly4Ser)3-linker基因片段经SOE-PCR组装成ScFv基因并重组入p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗体H103的重链可变区基因，其具有序列表<400>1的序列。

【技术特征摘要】
1.一种特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗体H103的重链可变区基因，其具有序列表<400>1的序列。2.由权利要求1基因编码的多肽产物，其具有序列表<400>3的序列。3.一种特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张思河，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12