本文提供了一种用于产生抗体诸如抗TNFα抗体(例如，英利昔单抗)的方法，所述抗体具有约20％至约70％的C端赖氨酸含量和约1％至约20％的唾液酸含量；所述方法包括在培养基中培养转染有编码所述抗体的DNA的锌响应宿主细胞，所述培养基包含至少0.5μM的锌；以及控制锌在所述培养基中的浓度，从而生产所述抗体。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于控制重组蛋白质中C端赖氨酸、半乳糖和唾液酸含量 的制造方法
技术介绍
通过血液流中的内源性循环羧肽酶（Cai, B等人，"体内人免疫球蛋白G2重 链的C端赖氨酸处理"，《生物技术与生物工程》，2011年；108:404-412 (Cai，B. et al., "C-terminal Lysine Processing of Human Immunoglobulin G2 Heavy Chain in Vivo, "Biotechnol. Bioeng. 2011 ; 108:404-412))，C 端赖氨酸（CTL)快速地从注入抗体移 除，包括英利昔单抗，并且因此据信对产品安全性和功效具有少量（如果有的话）影响。然 而，具有CTL残基的重组蛋白质中的CTL含量可用作制造一致性和产品均质性的量度。 相比于CTL含量，重组蛋白质中的唾液酸含量已与人的生理重要性的许多现象相 关联。例如，糖蛋白（诸如促红细胞生成素）中唾液酸的存在促进长循环半衰期，而促红细 胞生成素中唾液酸的不存在导致蛋白质从循环的快速清除。此外，蛋白质中增加的唾液酸 含量可调节人的蛋白质的免疫原性。由于唾液酸对产品安全性和功效的重要性，唾液酸含 量应保持在反应临床所用范围的范围内。 因此，存在理解并控制处理相关因数的需求，这些处理相关因数影响重组蛋白质 (特别是施用给人的重组蛋白质，诸如REMICADE ds (英利昔单抗）或HUMIRA? (阿 达木单抗））中的CTL和唾液酸含量。
技术实现思路
本文所公开的是用于生产抗体（例如，抗肿瘤坏死因子a (TNFa )抗体，诸如单克 隆抗体cA2(本文也称为英利昔单抗））的方法，该抗体通过控制培养条件（包括锌浓度、乙 二胺四乙酸（EDTA)浓度和收获时间）具有所需的C端赖氨酸（CTL)含量、唾液酸含量、半 乳糖含量和/或唾液酸对半乳糖的比率。 本专利技术的一个实施例是一种用于生产抗体的方法，该抗体具有约20%至约70% 的C端赖氨酸含量和约1 %至约20%的唾液酸含量；所述方法包括在培养基中培养转染有 编码抗体的DNA的锌响应宿主细胞，该培养基包含至少0. 5 μ M的锌；并且控制锌在培养基 中的浓度，从而生产抗体。在一些实施例中，抗体的C端赖氨酸含量为约40 %至约70%， 例如约55%至约65%，例如或约60%。在一些实施例中，抗体的唾液酸含量为约3%至约 14%。在一些实施例中，抗体具有约50%至约90%或约45%至约85%的半乳糖含量。在 一些实施例中，抗体具有约0. 05至约0. 20的唾液酸对半乳糖的比率。 在一些实施例中，抗体为抗TNFa抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TNFa抗 体或其抗原结合片段（i)竞争地抑制A2(ATCC保藏号ΡΤΑ-7045)结合至人TNFa ;和（ii) 以至少IX IO8升/摩尔的亲和力结合至人TNF a的中和表位，测量为缔合常数（Ka)。抗 TNFa抗体或其抗原结合片段可为例如嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在一些实施例中， 抗TNFa抗体或其抗原结合片段可为免疫球蛋白类IgGU IgG2、IgG3、IgG4或IgM，并且在 一些实施例中，包括IgGl恒定区域。在一些实施例中，抗TNF a抗体或其抗原结合片段选 自 Fab、Fab'、F (ab，）2和 Fv。 在一些实施例中，抗TNFa抗体或其抗原结合片段包括人恒定区域和非人可变区 域，或人恒定区域和人可变区域。 在一些实施例中，抗TNF a抗体或其抗原结合片段包含至少一个人轻链和至少一 个人重链。在一些实施例中，轻链包含A2 (ATCC保藏号PTA-7045)轻链的所有抗原结合区 域。在一些实施例中，重链包含A2 (ATCC保藏号PTA-7045)重链的所有抗原结合区域。在 其它实施例中，轻链包含A2 (ATCC保藏号PTA-7045)轻链的所有抗原结合区域，并且重链包 含A2 (ATCC保藏号PTA-7045)重链的所有抗原结合区域。 在一些实施例中，抗TNF a抗体或其抗原结合片段包含IgGl人恒定区域和非人可 变区域；该非人可变区域包含选自SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:5的氨基酸序列，或由选自 SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的核酸序列进行编码。 在一些实施例中，抗TNFa抗体或其抗原结合片段具有等同于单克隆抗体CA2的 表位特异性，并且在一些实施例中，抗TNF a抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体cA2。 在一些实施例中，锌在培养基中的浓度在约0. 6 μ M至约6. 5 μ M或约0. 6 μ M至约 I. 1 μΜ的范围内。 在一些实施例中，培养基还包含浓度范围为约2. 5μΜ至约30μΜ或约5μΜ至约 16 μ M的EDTA，并且所述方法还包括控制EDTA在培养基中的浓度。 在一些实施例中，所述方法还包括回收抗体，例如当培养基中的锌响应宿主细胞 达到约1. 5百万细胞/mL至约11百万细胞/mL或约3百万细胞/mL至约11百万细胞/mL 的细胞密度时。在一些实施例中，锌的浓度被控制，直至抗体被回收，或在锌响应宿主细胞 的对数生长期期间被控制。 在本专利技术的一些实施例中，控制锌的浓度包括监测锌在培养基中的浓度，和调 节锌在培养基中的浓度，以使得锌在培养基中的浓度为至少〇. 5 μΜ或在约0. 6 μΜ至约 6. 5 μΜ的范围内。 在本专利技术的一些实施例中，锌响应宿主细胞为SP2/0细胞。 本专利技术的另一个实施例是一种用于控制抗体的C端赖氨酸含量的方法，该抗体在 用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约20 %至约70 %的C端赖氨酸含量，所述方法 包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌 在培养基中的水平。 本专利技术的另一个实施例是一种用于控制抗体的唾液酸含量的方法，该抗体在用于 在培养基中生物合成抗体的过程中具有约1%至约20%的唾液酸含量，所述方法包括在抗 体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养基 中的水平。 本专利技术的另一个实施例是一种用于控制抗体的半乳糖含量的方法，该抗体在用于 在培养基中生物合成抗体的过程中具有约50%至约90%的半乳糖含量，所述方法包括在 抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物合成期间调节锌在培养 基中的水平。 本专利技术的另一个实施例是一种用于控制抗体中唾液酸对半乳糖的比率的方法，该 抗体在用于在培养基中生物合成抗体的过程中具有约〇. 05至约0. 20的唾液酸对半乳糖的 比率，所述方法包括在抗体的生物合成期间监测锌在培养基中的水平；以及在抗体的生物 合成期间调节锌在培养基中的水平。 在一种用于控制CTL、唾液酸或半乳糖含量，或唾液酸对半乳糖的比率的方法的一 些实施例中，抗体为抗TNF α抗体或其抗原结合片段，和/或抗体由SP2/0细胞生物合成。 在一个实施例中，抗体为结合TNF表位的氨基酸的mAb，mAb通过杂交瘤或重组宿 主生产。在一个实施例中，抗体为嵌合抗体，该嵌合抗体识别由A2所识别的表位。在另一 个实施例中，抗体为嵌合抗体，该嵌合抗体命名为嵌合A2 (cA2)(即，英利昔单抗）。 制备和使用抗TNF抗体的表征和方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生产抗体的方法，所述抗体具有约20％至约70％的C端赖氨酸含量和约1％至约20％的唾液酸含量，所述方法包括：在培养基中培养转染有编码所述抗体的DNA的锌响应宿主细胞，所述培养基包含至少0.5μM的锌；以及控制锌在所述培养基中的浓度，从而生产所述抗体。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M弗里克维特，C戈奇，F马斯兰卡，FJI纳格，J赖兰德，E谢弗，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，詹森生物制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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