一种高赖氨酸蛋白基因GhLRP及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新的高赖氨酸蛋白基因GhLRP，该基因是从棉花基因组中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明专利技术利用转基因技术将所述基因转化到禾本科植物中，实现了提高禾本科作物种子中赖氨酸和蛋白质含量的目的。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种新的高赖氨酸蛋白基因GhLRP，该基因是从棉花基因组中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本专利技术利用转基因技术将所述基因转化到禾本科植物中，实现了提高禾本科作物种子中赖氨酸和蛋白质含量的目的。【专利说明】一种高赖氨酸蛋白基因GhLRP及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种高赖氨酸蛋白基因及其应用。
技术介绍
赖氨酸作为人和单胃动物所必需的氨基酸，在主要禾谷类作物如玉米、水稻、小麦的种子中含量很低，成为主要的限制性氨基酸，严重影响了其营养品质。随着生物技术的发展，采用传统育种与分子育种相结合的方法，打破了物种生殖隔离的障碍，实现了物种之间基因的自由交流。而利用植物基因工程改良作物营养及加工品质，其应用潜力不仅仅在于提高初级农产品本身的价值，还涉及到加工成本的降低、加工工艺的简化、产品市场竞争力的提高等多个环节。通过转基因的方法提高作物中的赖氨酸含量，主要有以下几个途径:1、改变赖氨酸的合成代谢途径植物体中涉及到的赖氨酸代谢相关途径已经被研究的较为透彻，主要包括天冬氨酸代谢途径中涉及到的赖氨酸合成步骤以及赖氨酸分解相关代谢途径。天冬氨酸代谢途径是一个复杂的生化过程，该过程涉及到的第一个关键酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase, AK)和赖氨酸合成相关的第一个关键酶二氢批唳二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase, DHDPS)分别受赖氨酸和苏氨酸等代谢终产物的反馈抑制调节(Azevedoet al.，1997，2006)。植物中有两种类型的AK，即单功能酶AK和双功能酶AK-HSDH (aspartate kinase-homoserine dehydrogenase) (Wang et al.，2007)o 单功能酶AK受赖氨酸的反馈抑制调节，玉米中共有Askl和Ask2两个编码单功能AK的基因，当这些基因被突变后，AK对赖氨酸变得`不敏感，从而使游离的赖氨酸含量增加(Diedricketal., 1990; Dotson et al., 1990a, b;Muehlbaueret al.，1994a)。双功能酶AK受苏氨酸的反馈抑制调节，目前，在玉米cDNA中克隆出了三个编码双功能酶AK的基因，其中有两个基因被分别定位在2号染色体的长臂和4号染色体的短臂上(Muehlbaueret al., 1994b)。依据这些性质与特点，科研工作者们通过筛选突变体的技术开展了一些研究，希望筛选到含有对赖氨酸和苏氨酸不敏感的AK的突变体。在一些大麦突变体中，AK对赖氨酸的反馈抑制调节变得不敏感，结果使大麦种子中苏氨酸的含量提高了几倍，但是赖氨酸含量却没有被大量的提高(Bright et al., 1982;Rogneset al., 1983;Arruda et al.，1984)。同样的，在一些玉米突变体中，苏氨酸的含量也提高了几倍，但是赖氨酸含量却没有增加(Hibberd andGreen, 1982)。对这一现象，Bright等人解释说尽管AK受到抑制,但是DHDPS的活性仍然受到赖氨酸的反馈抑制调节，从而阻碍了赖氨酸含量的增加(Bright et al.，1982)。为了解决这个问题，一些赖氨酸不敏感的DHDPS突变体也被筛选出来(Frankard et al.，1992)，在一些突变体中，赖氨酸对DHDPS的反馈抑制作用减弱，使得植物叶片中的赖氨酸含量增加，但是种子中的赖氨酸含量却没有发生明显的变化(Negrutiuet al.，1984;Azevedoetal.，2002)。目前，一些有经济价值的高赖氨酸玉米品种已经作为动物的饲料被应用，如LY038，该转基因株系是通过在玉米胚中特异性表达来自谷氨酸棒状杆菌的对赖氨酸不敏感的DHDPS来实现的，转基因玉米种子中游离赖氨酸的含量为0.96mg/g (干重)，而野生型只有 0.05mg/g (Lucas et al.，2007)。2、降低醇溶蛋白含量，增加赖氨酸含量醇溶蛋白是谷类作物中含量最为丰富的一类蛋白，缺少赖氨酸和色氨酸，因此通过降低主要醇溶蛋白的含量也可以提高种子中赖氨酸的含量。在o2突变体中，醇溶蛋白的含量减少，但是受02调控的其它一些蛋白的表达也受到了影响，以至于玉米籽粒呈现出opaque表型。目前，主要是通过RNAi和转基因技术减少或抑制必需氨基酸缺乏的醇溶蛋白的表达。Segal等人构建了使编码22kDaa -zein基因沉默的RNAi载体，结果发现转基因玉米中赖氨酸含量提到，而且玉米籽粒表型正常(Segal et al.，2003)。Huang等人构建了使编码19kDaa -zein基因沉默的RNAi载体，结果种子赖氨酸、色氨酸和甲硫氨酸含量均增加(Huang et al., 2004)。此后,该课题组又构建了 RNAi的嵌合载体使19kDaa -zein和22kDaa -zein的合成积累量显著地减少，结果玉米种子中赖氨酸和色氨酸含量均增加(Huang et al., 2006)。3、引入编码富含赖氨酸蛋白的基因目前，主要有三种编码富含赖氨酸蛋白的基因被应用:(1)密码子经过改造的高赖氨酸蛋白基因；(2)人工合成的高赖氨酸基因(3)植物中或非植物中天然存在的高赖氨酸蛋白基因(Ufazet al.，2008)。(I)密码子经过改造的高赖氨酸蛋白基因该方法主要是将一些主要的储藏蛋白基因进行定点诱变或是向其插入编码富含赖氨酸的核苷酸序列。因此，选择合适的诱变或插入位点是实验成功与否的关键，主要是选择序列不保守的位置进行改造，避免使经改造的蛋白的结构、稳定性以及功能发生改变(Sun and Liu, 2004)。玉米中的醇溶蛋白是主要的储藏蛋白，而且赖氨酸缺乏，因此主要是通过改造一些醇溶蛋白基因来提高种子赖氨酸含量。最早的相关报道是将编码19kDaa-zein的基因进行改造，然后将其mRNA注射到非洲爪蟾的卵母细胞中，结果发现经过改造的19kDaa -zein在卵母细胞中的合成、加工、稳定性以及形成蛋白体等的性质没有改变(Wallace et al.，1988)。Torrent等人用富含赖氨酸的序列替代Y-zeins的富含脯氨酸的序列，然后将其在玉米中超表达，结果发现这些经过改造的Y-zeins在玉米胚乳相应的位置上大量的积累(Torrent et al.，1997)。(2)人工合成的高赖氨酸基因该方法主要是基于蛋白的结构、折叠、功能、拓扑等性质设计新的蛋白。基于玉米醇溶蛋白的结构特点，Kim等人设计并合成了一个新的储藏蛋白ASP1，该蛋白含有78.9%的必需氨基酸，在转基因烟草的叶片中以及其它植物中能够大量的合成与积累，使得氨基酸的含量提高(Kim et al., 1992 ；Zhang et al., 2003)。基于 α 螺旋的 coiled-coil 结构，Keeler等人设计了一个新的蛋白CP3-5，该蛋白含有31%的赖氨酸和20%的甲硫氨酸,用种子特异性启动子启动该基因在烟草中表达后发现该蛋白在烟草种子中大量稳定地积累，在一些转基因株系中甚至能达到种子总蛋白的2%，使得赖氨酸含量大幅提高(Keeler etal.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高赖氨酸蛋白基因GhLRP，其特征在于，所述高赖氨酸蛋白基因GhLRP的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于静娟，赵倩，朱登云，岳静，李丛，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：