使用重组负链RNA病毒载体表达异源蛋白质的方法技术

本发明专利技术提供一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法，所述方法包括通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染所述细胞以将至少一种异源核酸序列引入至细胞中，其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白。此外，本发明专利技术提供由所述方法体外制备的细胞或细胞群和包含所述细胞或细胞群的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用重组负链RNA病毒载体表达异源蛋白质的方法
本专利技术涉及一种使用复制缺陷的但有转录能力的重组负链RNA病毒在细胞中表 达至少一种异源核酸序列的方法。特别地，本专利技术涉及将细胞重编程为较低分化状态的体 外方法和使用所述重组负链RNA病毒载体的体内和体外基因治疗方法。此外，本专利技术涉及 由所述体外方法制备的细胞或细胞群和所制备的细胞或细胞群作为药物的用途。
技术介绍
重组病毒载体为已知可用于将外源基因引入哺乳动物细胞中W介导稳定的转基 因表达的几种试剂中的一种。已将不同的病毒用于该目的，包括逆转录病毒，疮疹病毒，腺 病毒，和腺相关病毒。该些重组病毒因其在病毒疫苗生产中的用途和作为基因治疗载体用 于治疗基因缺陷疾病而被知晓。重组病毒的其它应用包括通过逆转录病毒或慢病毒介导的 转导和特定细胞的重新分化和重编程因子的表达而将细胞去分化为被称作诱导性多功能 干细胞（iP巧的多能细胞。 在上述病毒介导方法中，与基因传递相关的一个严重问题是来自病毒载体的遗传 物质整合到宿主细胞基因组DNA中，该可导致宿主细胞的恶性转化。特别地，逆转录病毒介 导的基因（例如编码重编程因子的基因）传递，可导致转基因的基因组整合。该可能会触 发原癌基因的激活或破坏肿瘤抑制基因，导致细胞的恶性转化。与整合病毒载体相关的另 一个问题是整合的和下调的转基因可被重新激活导致细胞转化。 其它问题包括用于基因传递的病毒可被传递到患者的邻近的健康细胞或从患者 传递到其他个体或环境中的可能性。另一个问题是所述病毒载体可能存留并造成不良影 响，如对病毒成分的免疫反应或病毒性感染的延迟效应。此外，长期的外源基因的表达可导 致对自身抗原的类自身免疫反应或干扰细胞过程如信号通路。 为了增加在体外和体内过程中外源基因传递到宿主细胞的安全性，尤其是考虑到 所述病毒载体的不期望的传播，已提出不同的策略。例如，在WO2006/084746Al中描述了 复制缺陷的但有转录能力的负链RNA病毒。由于其改进的安全性，该种病毒被描述为适合 作为活疫苗使用。 此外，为避免基因插入祀细胞基因组中引起的任何问题，尝试引入不在祀细胞基 因组中整合的病毒基因构建体并允许异源基因产物的瞬时表达。例如，WO2010/008054Al 描述了一种用染色体非整合的病毒载体如仙台病毒（Sendaivirus)载体生产类ES(胚细 胞）细胞的方法。然而，该病毒载体能在被感染的祀细胞中有效复制，并因此所生成的病毒 颗粒将在每次细胞分裂后的子细胞中均匀分布。因此，所产生的类ES细胞在它们的细胞质 中包含不需要的高病毒载量。 在WO2010/134526Al中描述了相似的方法，其中仙台病毒载体被用于将体细胞 重编程为诱导性多能干细胞（iPS)，所述仙台病毒载体不导致载体序列整合入宿主细胞的 基因组中，并因此降低由载体序列随机整合入宿主基因组引起的致瘤性转化的风险。然而， 由于WO2010/134526Al中所描述的仙台病毒载体是有能力复制的，在重编程后需要付出 相当大的努力去除它W确保足够的安全性。此外，由于在WO2010/134526Al使用的用于 去除所述病毒的SiRNA的递送率（deliveryrate)和SiRNA介导的表达抑制都没有达到 100%，该方法不能充分的排除与使用活病毒相关的健康风险。 专利技术目的 考虑到现有技术，本专利技术的目的是提供一种具有改进的安全性且能在足够长的时 期内有效地表达异源核酸序列的新型病毒载体。特别地，本专利技术旨在提供用于在祀细胞中 传递和表达编码治疗性蛋白质的基因的方法，作为用于多种疾病的基因治疗方法。此外，本 专利技术旨在传递和表达编码细胞重编程或编程因子的基因W将至少部分分化的细胞重编程 为适合在再生治疗中使用的较低分化的细胞或将细胞编程为具有所需分化状态的细胞。 专利技术概沐 第一方面，本专利技术涉及一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法。所述方 法可为体内或体外方法且包含通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载 体感染细胞将至少一种异源核酸序列引入至细胞中的步骤，其中所述重组负链RNA病毒载 体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒 基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白质。 在一个优选的实施方案中，通过体外方法将至少部分分化的细胞重编程为较低分 化的细胞，所述体外方法包括；(a)提供来自供体的至少部分分化的细胞，化）通过用包含 至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染所述细胞W将至少一种异源核酸序 列引入至所述细胞中，和（C)在能有效表达所述至少一种异源核酸序列的条件下培养所述 受感染的细胞，其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而 病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编 码细胞重编程因子。 在另一个优选的实施方案中，通过体外方法将要被编程的细胞编程为所需的分化 状态，所述体外方法包括：(a)提供来自供体的要被编程的细胞，化）通过用包含至少一种 异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染所述细胞W将至少一种异源核酸序列引入至 所述细胞中，和（C)在能有效表达所述至少一种异源核酸序列的条件下培养所述受感染的 细胞，其中所述重组负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录 能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞编 程因子。 在另一个优选的实施方案中，通过体内方法治疗遗传病，所述体内方法包含将包 含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体施用于患者W将所述至少一种异源核 酸序列引入至患者细胞中，其中所述重组负链RNA病毒包括编码导致病毒基因组复制能力 丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸 序列编码能治疗所述遗传病的治疗性蛋白质。 在另一个仍然优选的实施方案中，通过体外方法治疗遗传病，所述体外方法包含： (a)提供来自供体的细胞，化）通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体 感染所述细胞W将至少一种异源核酸序列引入至所述细胞中，和（C)在能有效表达所述至 少一种异源核酸序列和/或允许细胞扩增的条件下培养所述受感染的细胞，其中所述重组 负链RNA病毒载体包括编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变 的P蛋白的病毒基因组，且其中所述至少一种异源核酸序列编码能治疗所述遗传病的治疗 性蛋白质。 第二方面，本专利技术涉及通过本专利技术所述体外方法制备的细胞或细胞群。该细胞和 细胞群可用于药物，尤其是用作在基因治疗或再生治疗中使用的药物。 第H方面，本专利技术涉及包含由本专利技术所述体外方法制备的细胞或细胞群，或包含 源自通过本专利技术体外重编程方法制备的细胞或细胞群的再分化的细胞或再分化的细胞群 的药物组合物。 本专利技术优选的实施方案在权利要求书中提出。 通过参考下面详细的说明、实施例和附图可更加充分地理解本专利技术。 【附图说明】 图1显示了用SeV-PA2-77/GFP(绿色英光蛋白）转导的Vero细胞在第一天（本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法，所述方法包括：通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染细胞，将所述至少一种异源核酸序列引入至所述细胞中，其中所述重组负链RNA病毒载体包含编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.30 EP 12004148.8;2012.05.30 US 61/652,9131. 一种在细胞中表达至少一种异源核酸序列的方法，所述方法包括： 通过用包含至少一种异源核酸序列的重组负链RNA病毒载体感染细胞，将所述至少一 种异源核酸序列引入至所述细胞中， 其中所述重组负链RNA病毒载体包含编码导致病毒基因组复制能力丧失而病毒转录 能力不丧失的突变的P蛋白的病毒基因组，和 其中所述至少一种异源核酸序列编码细胞重编程或编程因子或治疗性蛋白质。2. 根据权利要求1所述方法，其中所述重组负链RNA病毒载体为副粘病毒包括仙台 病毒，副流感病毒，鸡新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，牛瘟病毒和人类呼吸道合胞体病 毒，或弹状病毒载体包括水疱性口炎病毒或狂犬病病毒。3. 根据权利要求1或2所述方法，其中所述P蛋白的突变为仙台病毒P蛋白的氨基酸 序列2-77的一个或多个氨基酸的缺失、插入或替换，或如果不是仙台病毒，则为与仙台病 毒P蛋白的氨基酸序列2-77同源的氨基酸序列的缺失、插入或替换。4. 根据权利要求3所述方法，其中所述突变为 (a) 仙台病毒P蛋白的氨基酸2-77的缺失或，如果病毒不是仙台病毒，则为与仙台病毒 P蛋白的氨基酸2-77同源的氨基酸的缺失，或 (b) 仙台病毒P蛋白的氨基酸33-41的缺失或，如果病毒不是仙台病毒，则为与仙台病 毒P蛋白的氨基酸33-41同源的氨基酸的缺失。5. 根据权利要求1-4任一项所述方法，其中所述细胞重编程因子选自由Nanog、 Oct-3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、ASCL1、MYT1L、TBX3b、SV40 大T、hTERT、miR-291、 miR-294、miR-295及其组合组成的组，和/或其中所述编程因子选自由神经生长因子 (NGF)、纤维母细胞生长因子（FGF)、白细胞介素-6(IL-6)、骨形成蛋白（BMP)、神经源素 3(Ngn3)、胰腺十二指肠同源框l(Pdxl)、田安（Mafa)及其组合组成的组。6. 根据权利要求1-5任一项所述方法，其中所述治疗性蛋白选自由腺苷脱氨酶（ADA)、 P91-PH0X、因子IX、因子VIII、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR)、0 -球蛋白（HBB)、抗 肌萎缩蛋白、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT)、苯丙氨酸羟化酶（PAH)、葡糖苷酰 鞘氨醇酶（GBA和GBA2)、原纤蛋白-l(FBNl)、亨廷顿蛋白（HTT)、载脂蛋白B(apoB)、低密 度脂蛋白受体（LDLR)、低密度脂蛋白受体衔接蛋白l(LDLRA...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽安·维甘德，
申请(专利权)人：阿穆瓦克有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH