双质粒哺乳动物表达系统技术方案

反向工程提供了研究RNA病毒感染的病理学的新方法、合成重组病毒和开发疫苗的新的更有效的手段，并且还证明了RNA依赖性RNA聚合酶RDRP系统作为表达系统的通用性和效率。然而，目前使用的方法需要全套复杂的、难以使用的工具。本发明专利技术描述了一种基于更简单质粒的哺乳动物的表达系统，其利用RDRP酶活性用于表达重组蛋白或来自病毒小基因组的RNA以及从编码负链RNA病毒的整个基因组的cDNA拯救重组病毒。该系统将可用于表达重组蛋白、包括反义RNA和/或选择性干扰RNA的治疗性RNA分子和核酶。该系统还可用于基因治疗以及制备用于生产新疫苗的重组病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双质粒哺乳动物表达系统
本专利技术涉及双质粒哺乳动物表达系统。此外，本专利技术涉及重组蛋白和病毒的生产。此外，本专利技术涉及结合用于重构负链RNA病毒的核糖核酸(RNA)依赖性RNA聚合酶的方法的哺乳动物表达系统以及其作为用于生产蛋白、RNA分子和重组病毒的哺乳动物表达系统的开发。
技术介绍
分子生物学和基因工程的进步推动了“反向遗传学”的发展，其为一种由病毒基因组的克隆的互补DNA(cDNA)拷贝产生重组病毒的方法。它有助于理解涉及病毒减毒、组织嗜性毒力因子(tissuetropismvirulencefactors)的分子决定因素，并且近年来，通过操纵其cDNA能够易于修饰病毒基因组加快了病毒疫苗的开发。反向遗传学使生产具有减毒突变的重组病毒或表达外源性基因的嵌合病毒用于作为新病毒疫苗或治疗剂使用成为可能。麻疹病毒(麻疹病毒和牛瘟病毒)MV和RPV是副粘病毒科麻疹病毒属的成员。它们的遗传信息编码在反义极性的单链RNA基因组上并分别包含15894(MV)个和15882(RPV)个核苷酸。它们的基因组具有分别称为前导和尾随的独特的高度保守的3’端和5’端并编码由相似保守的基因间序列分隔的6个基因——N(核壳体蛋白)、P(磷蛋白)、M(基质蛋白)、F(融合蛋白)、H(血凝素)、和L(大蛋白＝聚合酶)。在被感染的细胞中，病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)由其存在于前导序列中的启动子起始转录基因组RNA并产生信使核糖核酸(mRNA)分子，该mRNA分子由细胞核糖体翻译成相应的蛋白。在病毒生命周期的某些点(时刻)处以及合成足够汇集的病毒蛋白后，RDRP酶转变模式并从存在于基因组RNA的前导序列中的另一个启动子起始复制。虽然对调节转录的起始或病毒RNA的复制以及在基因边界处的转录开始和停止的确切机制知之甚少，但是一般在大多数负链RNA病毒并且特别是在MV和RPV的情况下，用作用于转录和复制的启动子的保守序列以及在各基因边界指示转录开始和停止的序列被明确定义。公认的是将这些序列添加到任何不相关的RNA分子形成可以由其同源RDRP转录和复制的“病毒基因组样复制子”。MV引起婴幼儿急性发热疾病。可通过接种疫苗有效控制其流行。包括Schwartz、Moraten和Edmonston-Zagreb株在内的大多数目前使用的活减毒疫苗通过非人体细胞中的多个通道(Enders，1962)衍生自原始的Edmonston株(Enders和Peebles，1954)。然而，根据世界卫生组织(WHO)估计，每年一百万主要在发展中国家的幼儿死于麻疹。但是近年来未完全遵守疫苗接种的发达国家如美国已出现麻疹相关死亡例(Clements和Cutts，1995)。对于包括未来趋势的MV疫苗学的最近讨论参见Norrby(1995)。在过去的60多年里，已有超过7亿儿童接种过麻疹疫苗，且麻疹疫苗被证明是高效的，通常提供对于MV再感染的终身免疫。RPV引起牛瘟——一种牛、水牛或其他野生物种的病毒性传染病，主要发生在印度、非洲和其他热带国家。其特征为发热、口腔糜烂、腹泻、淋巴坏死及高死亡率。两种疫苗——Plowright(Plowright和Ferris，1962)和Lapinized(Scot1963)已被广泛用于保护对抗牛瘟。由RPV的RBOK株的减毒衍生出的Plowright疫苗被证明是最有效的(Baron等人，2005)。到2000年，广泛使用这些疫苗帮助包括印度在内的几个国家根除了RPV。然而，其在2003年的再度出现导致牛和其他易感动物重新开始大规模接种疫苗(Kock等人，2006)。这些疫苗安全性和有效性的证明支持它们作为用于表达外源性基因的理想的载体。反向遗传学提供用于开发在人或动物内用作潜在对抗不相关疾病的疫苗和/或治疗剂的重组MV或RPV的有效手段。在1981年在脊髓灰质炎病毒的案例中由Racaniello和Baltimore首次将反向遗传学用于产生RNA病毒。随后，使用由T7或T3RNA聚合酶(Racaniello,V.R.&Baltimore,D.,1981)从克隆的cDNA生产的合成RNA产生数个其他的正义RNA病毒。然而，证明更难产生负链RNA病毒。与正链RNA病毒不同，负义(反义，negativesense)病毒的基因组不能被宿主细胞翻译且无传染性。它必须以包含核蛋白质和病毒RDRP蛋白的核蛋白(RNP)复合体的形式提供以容许其转录和复制以及随后的病毒形成。Enami等人(1990)开发了第一个反向遗传学系统来生产流感病毒(其由9个基因组RNA亚单元组成)。它的RNP尺寸小且可在体外由RNA和所需的病毒蛋白(N和聚合酶组件)组装。最初，使用携带报告基因——嵌入流感病毒基因组亚单元的病毒非编码末端序列的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)序列的人工RNA(Luytjes等人，1989)。随后，也使用在体外从克隆的DNA转录的单个真实的(authentic)或改变的基因组亚单元RNA(Enami和Palese，1991)。由于分别被CAT产量和流感病毒的拯救监控，组装的RNP在转染到流感感染的细胞中时复制并转录。在一些情况下可以通过选择实现从大量过量的非再分类病毒(non-reassortedvirus)纯化包含引入的亚单元的病毒，例如，使用直接抵抗由辅助病毒的同源亚单元编码的蛋白的特异性中和抗体。非节段(non-segmented)负链RNA病毒(单股反链病毒目，Mononegavirales)的RNP除N蛋白外还包含组装和聚合酶辅因子磷蛋白(P)以及病毒RNA聚合酶(大蛋白L)，并更难以在体外由合成RNA和单独的蛋白质组装。因此，许多研究员倾向于使用包含病毒生命周期期间产生的病毒基因组必要序列的更小的亚基因组RNA(病毒小基因组)。然后它们被人工转录的RNA分子替代，该RNA分子来自包含报告基因和病毒必要非编码序列(复制子)的DNA结构。对于仙台病毒(Park等人，1991)、仙台病毒(SeV)、呼吸道合胞体病毒(Collins等人，1993；Collins等人，1991)、人类副流感病毒3(Dimock和Collins，1993)、狂犬病病毒(RV)(Conzelmann和Schnell，1994)和MV(Sidhu等人，1995)实现了此类携带CAT编码序列和病毒必需非编码末端序列的复制子的复制。使用类似的系统来从在T7RNA聚合酶启动子控制下的病毒基因组的全长cDNA的克隆彻底拯救水泡性口炎病毒(VSV)(Lawson等人，1995；Schnell等人，1994)和狂犬病病毒(RV)。由被T7RNA聚合酶启动子控制的蛋白质表达质粒提供包括核蛋白质(NP)的病毒聚合酶复合体组件。不久，对于水泡性口炎病毒(Whelan等人，1995)、麻疹病毒(Radecke等人，1995)、呼吸道合胞体病毒(Collins等人，1995)、仙台病毒(Garcin等人，1995；Kato等人，1996)、牛瘟病毒(Baron&Barrett，1997)、人类副流感病毒(Hoffman等人，1997；Durbin等人，1997)、猿猴病毒(simianvirus)(He等人，1997)、新城疫病毒(Peeters等人，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用非分段负链RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶用于生产重组蛋白的双质粒系统，无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助，包含：a.一种克隆质粒，包含在两个用于插入可表达DNA片段的多克隆位点处的易于操作的复制子；b.一种辅助质粒，包含分别表达N、P、L蛋白的N、P、L基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.08 IN 1678/MUM/20111.一种使用非节段负链RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶用于生产重组蛋白的双质粒系统，无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助，包含：a.一种克隆质粒，包含在两个用于插入可表达DNA片段的多克隆位点处的易于操作的复制子，所述克隆质粒是按照SeqIDNO.4或SeqIDNO.5或SeqIDNO.6或SeqIDNO.7，所述易于操作的复制子是按照SeqIDNO.1或SeqIDNO.2或SeqIDNO.3；b.一种辅助质粒，包含分别表达N、P、L蛋白的N、P、L基因，所述辅助质粒是按照SeqIDNO.8或SeqIDNO.9。2.根据权利要求1所述的双质粒系统，其中，所述易于操作的复制子包含至少两个在5’端由病毒前导序列侧接并且在3’端由病毒尾随序列侧接的用于插入可表达DNA片段的多克隆位点(MCS)，由病毒基因间序列分隔，操作地连接到RNA聚合酶(RNAP)I调控序列以容许合成带有真实的3’和5’病毒基因组末端的反义RNA转录本。3.根据权利要求1所述的双质粒系统，其中，所述易于操作的复制子包括至少两个在5’端由病毒前导序列侧接并且在3’端由病毒尾随序列侧接的用于插入可表达DNA片段的多克隆位点(MCS)，由病毒基因间序列分隔，操作地连接到RNAPII调控序列和核酶以容许合成带有真实的3’和5’病毒基因组末端的反义RNA转录本。4.一种使用非节段负链RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶用于生产传染性非节段负链RNA病毒的双质粒系统，无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助，包含：a.一种病毒克隆质粒，包含编码麻疹病毒的整个病毒的基因组RNA的cDNA用于插入可表达的DNA片段；b.一种辅助质粒，包含分别表达N、P、L蛋白的N、P、L基因，所述辅助质粒是按照SeqIDNO.8或SeqIDNO.9。5.根据权利要求4所述的双质粒系统，其中，所述编码病毒基因组RNA的cDNA被操作地连接到RNA聚合酶(RNAP)I调控序列以容许合成带有真实的3’和5’病毒基因组末端的反义RNA转录本。6.根据权利要求4所述的双质粒系统，其中，所述编码病毒基因组RNA的cDNA可操作地连接到RNAPII调控序列以容许合成带有真实的3’和5’病毒基因组末端的反义RNA转录本。7.根据权利要求1或权利要求4所述的双质粒系统，其中，所述可表达DNA片段编码RNA分子或蛋白或至少一个免疫原性表位或它们的组合。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：维什瓦斯·乔希，
申请(专利权)人：维什瓦斯·乔希，
类型：发明
国别省市：印度;IN