一种治疗代谢疾病的突变细胞因子融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了新的突变人细胞因子及其融合蛋白在治疗代谢疾病中的作用，本发明专利技术提供的哺乳动物细胞表达突变的人细胞因子为序列表SEQ ID NO:3所示的蛋白质。本发明专利技术对野生型人细胞因子基因进行突变和N端改造，所述的融合蛋白含有人细胞因子突变体和人IgG4的Fc段（CH2-CH3）。本发明专利技术提供的哺乳动物细胞表达重组细胞因子融合蛋白具有良好的降血糖活性，特别是所述融合蛋白，还具有稳定性高、半衰期长等优点。并且本发明专利技术提供的融合蛋白还能较好的控制血糖的波动，稳定维持24小时血糖处于正常水平。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及突变的细胞因子，尤其涉及突变的人源细胞因子，本专利技术还涉及该突变的人源细胞因子在制备治疗代谢疾病药物中的用途，属于突变细胞因子领域。
技术介绍
糖尿病是危及全球的一种严重的代谢疾病，目前我国糖尿病患者已达4000万左右，患病率已由十几年前的1%增长至目前的2.5%，并以每年1‰的速度递增。糖尿病已经成为继心脑血管疾病和癌症之后威胁人类健康的第三大杀手。目前仍缺少治愈糖尿病的方法，临床上对糖尿病以药物控制为主，患者需要终身服药以达到控制血糖水平，减轻糖尿病的症状，延缓并发症的出现的目的。现临床应用的糖尿病药物极易引起一些较严重的副作用，如低血糖、体重增加、心血管毒等副作用。而且由于糖尿病后期多数患者体内胰岛素抵抗现象严重，导致大部分依赖胰岛素通路的药物失效，给糖尿病治疗带来较大困难。因此，探寻更有效，安全的，尤其是可不依赖胰岛素途径独立调节血糖的新型药物一直是糖尿病的治疗研究中现实而紧迫的任务。成纤维细胞生长因子-21是2000年发现的FGF家族一员，主要在肝脏中表达。经研究发现，FGF21能够高效并持续调节机体糖脂代谢，刺激脂肪细胞的葡萄糖吸收，降低ob/ob和db/db小鼠血浆中葡萄糖和甘油三脂的浓度，并且FGF21可以有效降低糖尿病动物胰岛素水平，改善胰岛素抵抗，不依赖胰岛素进行血糖调节，而且也不会导致类似胰岛素等药物大剂量用药造成的低血糖。更为值得我们注意的是它不同于同家族的其它因子，不会引起细胞的增殖。因此，FGF21有望成为治疗2型糖尿病新型潜力药物。人免疫球蛋白IgG在体内的半衰期为20d，其稳定性是由于IgG的Fc片段与新生Fc受体（FcRn）结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白的体内半衰期，达到长效的目的。蛋白稳定性的高低直接影响其在宿主细胞中的表达量，为了提高产量，并在不影响蛋白原有活性的基础上，需要将FGF21进行适当的突变，通过与人IgG4的Fc片段连接成融合蛋白的形式来提高FGF21的稳定性，这将加快FGF21的中试生产，对临床具有非常重要的意义。中国仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovarycell,CHOcell）属于高等哺乳动物成纤维细胞，是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。与原核及酵母等表达系统相比，CHO细胞所具有的优点包括：1）具有准确的翻译后修饰功能，如糖基化、磷酸化、酰基化、二硫键形成等，使其表达的蛋白在分子结构、生物学功能等方面非常接近天然的蛋白；2）具有产物胞外分泌的功能，有利于外源蛋白的分离纯化；3）具有外源基因的高效扩增和表达能力，且基因整合稳定；4）属于半悬浮性细胞，具有贴壁生长特性，耐受剪切力和渗透压的能力较强，亦可进行悬浮的规模性培养，表达水平较高；5）属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源性蛋白，利于外源蛋白纯化。筛选用表达载体结构优化。由于外源基因导入哺乳动物细胞的效率很低，从整合并表达外源基因的工程细胞中筛选出高表达的细胞克隆是一项很费时费力的工作。首先要依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统。本专利优化的筛选用表达载体pBMN同时整合了谷氨酰胺合成酶（GS）筛选系统。GS筛选系统有以下两个优点：1）有相对较高的外源基因扩增和表达能力。使用GS体系仅需一轮放大，就能筛选到有效的外源基因表达水平，而较DHFR基因扩增系统筛选效率高出一倍。2）谷氨酰胺合成酶是利用氨与谷氨酸合成谷氨酰胺的，此过程缓解了培养过程中氨积累的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供突变人FGF21及其编码核酸和氨基酸序列。本专利技术的目的之二是提供突变人FGF21与人IgG4Fc段融合蛋白及其编码核酸和氨基酸序列。本专利技术的目的之三是构建优化的高通量筛选用表达载体pBMN。本专利技术的目的之四是提供含有突变人FGF21基因和其与人IgG4Fc段连接基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。本专利技术目的之五是将该突变人FGF21和其与人IgG4Fc融合蛋白应用于制备成治疗糖尿病的药物或药物组合物。本专利技术上述的内容是通过以下技术方案来实现的：本专利技术人通过将含有GS片段的pBMN载体，用NotI和SalI双酶切连入重组外源基因（FGF21片段），构建出具有双顺反子的真核重组表达载体pBMN，该载体可以通过GS加压筛选方式快速获得稳定高表达重组细胞株。本专利技术将人FGF-21基因进行突变得到mhFGF21，相比于突变前，mhFGF21基因在宿主细胞中的表达量显著提高且活性显著增强。含有该突变的mhFGF21核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也当然的包括在本专利技术的保护范围之内。为了提高重组mhFGF21的可溶性表达，可以将mhFGF21核苷酸序列与人IgG4Fc段连接，再将其克隆到表达载体中。其中，优选的，所述的表达载体可以是pBMN，所述的宿主细胞可以是CHO-K1SV；所述融合肽为人IgG4的Fc段。本专利技术提供了一种纯化hFGF-21或mhFGF21的方法，包括：将表达载体转染至宿主细胞；筛选稳定细胞系后培养表达目标蛋白，离心收集培养基，对澄清后的上清进行离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化目标蛋白，即得纯度较高的hFGF-21或mhFGF21蛋白。本专利技术还提供了一种纯化mhFGF21-Fc或Fc-mhFGF21的方法，包括：将表达载体转染至宿主细胞；筛选稳定细胞系后培养表达融合蛋白，离心收集培养基，利用ProteinA/G亲和层析，凝胶过滤层析从澄清后上清中分离纯化融合蛋白，即得纯度较高的mhFGF21-Fc或Fc-mhFGF21蛋白。细胞试验和动物学试验结果表明，本专利技术突变mhFGF21相比于野生型hFGF21，活性显著提高，能够更加有效降低糖尿病小鼠体内的血糖水平，此外，并且本专利技术突变体还能较好的控制血糖波动，稳定维持24小时血糖处于正常水平。特别是mhFGF21与Fc连接的融合蛋白，其降糖效果更佳。本专利技术突变hFGF21或其融合蛋白可作为药物治疗糖尿病，肥胖症或代谢综合症等代谢疾病。附图说明图1纯化后的hFGF21、mhFGF21蛋白的SDS-PAGE电泳分析。图2纯化后的Fc-mhFGF21、mhFGF21-Fc融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析。图3突变蛋白mhFGF21、Fc-mhFGF21和mhFGF21-Fc的体内稳定性的检测。图4突变后的mhFGF21、mhFGF21-Fc和Fc-mhFGF21细胞活性检测。图51型糖尿病小鼠注射不同蛋白14d内血糖变化。图61型糖尿病小鼠注射不同蛋白8周后24小时血糖波动。图71型糖尿病小鼠注射不同蛋白8周后糖化血红蛋白变化。图82型糖尿病db/db小鼠注射不同蛋白13d内血糖变化。图92型糖尿病db/db小鼠注射不同蛋白8周后24小时血糖波动。图102型糖尿病db/db小鼠注射不同蛋白8周后糖化血红蛋白变化。具体实施方案：下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。说明：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变细胞因子mhFGF21，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示。

【技术特征摘要】
1.一种突变细胞因子mhFGF21，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:4所示。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因，其核酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。3.人IgG4的Fc段（CH2-CH3），与权利要求1所述蛋白质的C端连接的融合蛋白mhFGF21-Fc，其序列如序列表中SEQIDNO:5所示；人IgG4的Fc段（CH2-CH3），与权利要求1所述蛋白质的N端连接的融合蛋白mhFGF21-Fc，其序列如序列表中Fc-mhFGF21序列表的SEQIDNO:6所示。4.编码权利要求3所述蛋白质的基因，融合蛋白mhFGF21-Fc和mhFGF21-Fc其核酸序列如序列表中SEQIDNO:2和序列表的SEQIDNO:3所示。5.含有权利要求2或权利要求4所述的基因的表达载体和表达载体的宿主细胞，所用表达载体优选为构建成功的PBMN载体，宿主细胞优选是中国仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovarycell,CHO-K1SVcell）。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：深圳红石科创生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44