肿瘤坏死因子突变蛋白制造技术

对人Ｐ７５－ＴＮＦ受体比对人Ｐ５５－ＴＮＦ受体具有更高结合亲和力的人ＴＮＦ突变蛋白包括在相应于野生型氨基酸顺序的３３、６５、６７、７５、８７、１４３、１４５或１４７位上具有至少一个不同于野生型人ＴＮＦ的氨基酸。 这类突变蛋白被用于描述人Ｐ７５受体的特征，并与于对人Ｐ５５－ＴＮＦ受体具有选择性结合亲和力的已知突变蛋白一起有助于区分通过结合人Ｐ７５受体所介导的ＴＮＦ功能与通过结合人Ｐ５５受体所介导的ＴＮＦ功能的不同。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤坏死因子突变蛋白。肿瘤坏死因子，或者更确切地讲称为肿瘤坏死因子α(为参照方便起见，除非有其它说明，本文所用的“肿瘤坏死因子”或“TNF”是指TNF-α)，是一种细胞激活素，主要由被刺激的巨噬细胞产生，它不仅显示出对抗各种肿瘤细胞的显著细胞毒性，而且还作为炎症和免疫反应的介质发挥多种作用。根据已在E.coli中克隆和表达的人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)的cDNA的核苷酸顺序，人们已推测出hTNF-α的基本结构。已发现在hTNF-α与人淋巴毒素的氨基酸顺序之间存在着惊人的同源性(30%)，后者常被称为人肿瘤坏死因子-β(hTNF-β)，是一种主要由被激活的淋巴细胞产生的一种细胞激活素。所谓TNF-α突变蛋白，是具有修饰了氨基酸顺序的hTNF-α，各种出版物已对此进行过描述例如Yamagishi et al.，protein Engineering 3，713-719，(1990);Fiers，“Tumor Necrosis FactorsStructure，Function and Mechanism of Action”;Fiers et al.，Bonavista and Granger，PP.77-81(同上);Goh et al.，(1991)，“Structural and functional domains in human tumor necrosis factors”.Prot.Engineering 4385-389;Kircheis et al.，(1992)“Biological activity of mutants of human tumor necrosis factor-alpha，”Immunology 76433-438;Van Ostade et al.，(1991)“Localization of the active site of human tumor necrosis factor(hTNF)by mutational analyses，”EMBO J.10827-836;Van Ostade et al.，(1993)“Humman TNF mutants with selective activity on the p55 receptor，”Nature 361266-269;Zhang et al.，(1992)“Site-directed mutational analysis of human tumor necrosis factor-α receptor binding site and structure-functional relationship，”J.Biol.Chem.26724069-24075;和Ito et al.，(1991)，“Novel muteins of human tumor necrosis factor alpha，”Biochim.Biophys.Acta 1096245-252。此外，TNF-α突变蛋白曾是多件专利申请的主题，例如WO 86/02381、WO 86/04606、WO 88/06625和EP155，549、EP158，286、EP168，214、EP251，037、EP340，333以及DE3843534。现有技术中也曾公开过淋巴毒素的突变蛋白，例如，EP250，000、EP314，094和E336，383以及下面两篇文献Goh et al.，(1991)“Aspartic acid 50 and tyrosine 108 are essential for receptor binding and cytotoxic activity of tumor necrosis factor beta(lymphotoxin)，”prot.Engineering 4785-791;和Wakabayashi et al.，(1990)“Deletion of lysine 89 enhances the cytotoxicity and the receptor binding affinity of human lymphotoxin，”J.Biol Chem.2657604-7609。TNF的生物作用是通过特异性受体介导的，所说受体即指一种在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上表观分子量为55KD的受体(p55-TNF-R)和一种在SDS-PAGE上表观分子量为75KD的受体(p75-TNF-R)。这两种形式的TNF受体都已被克隆，也就是分别由Loetscher等人描述的p55-TNF-R和例如由Dembic等人描述的p75-TNF-R(对于两种受体也可参见欧洲专利申请90116707.2)。新近发现，这两种受体不仅结合TNF-α，而且还以高亲和力与TNF-β结合。现有技术已清楚地了解到，基于TNF-α的生物活性，它可成为用于治疗各种疾病的有价值的化合物，例如，TNF-α本身或与干扰素联合可作为有效的抗肿瘤剂。然而，TNF-α的全身性毒性是其被广泛用于治疗的主要限制因素。hTNF-α和mTNF-α几乎以同等亲和力与人p55-TNF-R和人p75-TNF-R相结合，但是，已经证明人TNF-α(hTNF-α)在小鼠中仅与较小的小鼠TNF受体(鼠p55-TNF-R)结合。在小鼠中，hTNF-α的毒性远低于鼠TNF-α(mTNF-α)，后者与鼠受体mp55-TNF-R和mp55-TNF-R都能结合。例如，在C57B16小鼠中，mTNF-α和hTNF-α的LD50分别为约10μg/小鼠和500μg/小鼠。因此，人们认为p75-TNF-R在全身性毒性方面起着特别的作用。据报道，增生信号可以由人T淋巴细胞中的hp75-TNF-R所介导(Gehr et al.，J.Immunol.149，911，1992;Tartaglia etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，9292，1991)。人肿瘤坏死因子突变蛋白在其与人p75-肿瘤坏死因子受体(hp75-TNF-R)和人p55-肿瘤坏死因子受体(hp55-TNF-R)的结合亲和力之间明显不同，这在EP486908中已经描述过，其中公开了维持与hp55-TNF-R的结合活性但几乎完全丧失了与hp75-TNF-R的结合活性的hTNF突变蛋白。本专利技术提供了一种对人p75-TNF-R具有比对人p55-TNF-R更高结合亲和力的人肿瘤坏死因子突变蛋白(本文所用术语“人肿瘤坏死因子突变蛋白”包括药用的人肿瘤坏死因子突变蛋白盐)。Pennica等人公开的(野生型)人TNF-α的氨基酸顺序如下1 10VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO SER ASP LYS PRO VAL ALA HIS20 30VAL VAL ALA ASN PRO GLN ALA GLU GLY GLN LEU GLN TRP LEU ASN40ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY VAL GLU LEU ARG ASP50 60ASN GLN L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对人ｐ７５－ＴＮＦ受体比对人ｐ５５－ＴＮＦ受体具有更高结合亲和力的人ＴＮＦα突变蛋白或其药用盐。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D班纳，W列斯劳尔，H勒舍，D施图伯，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]