本发明专利技术提供了M蛋白三氨基酸位点突变的猪用VSV病毒载体构建和应用。该猪用水泡性口炎病毒载体为基质蛋白(M)三氨基酸位点突变的重组病毒VSV-MT，该病毒M蛋白的第51位甲硫氨酸被敲除,第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸，第226位甘氨酸突变为精氨酸。本发明专利技术获得的猪用水泡性口炎病毒载体，致病性极低，安全性高，并且能有效激发机体产生保护性免疫应答反应，可用于制备疫苗或疫苗载体，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株基质蛋白（M)三氨基酸位点突变的新型猪用水泡性口炎病毒载 体的构建和应用。
技术介绍
家畜水泡性口炎由水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV)引起，是 一种急性、高致病性传染病，可在全世界范围内对畜牧业造成危害，在我国被列为二类动物 传染病，目前尚无有效的疫苗予以预防。 水泡性口炎由水泡性口炎病毒（VSV)引起，可使牛和猪致死。受感染的动物表现 为发热、嗜睡、食欲下降；口腔、乳头、趾间及蹄冠上出现水泡性病灶和腿部的罐状环带。水 泡易破裂，露出肉芽组织，呈红色糜烂，常在7~10天内完全疫愈。水泡性口炎直接导致动 物死亡较少，但可造成局部继发细菌和真菌感染，从而导致跛行、体重下降、出奶下降和乳 腺炎等，带来重大经济损失。VSV可在全世界范围内对畜牧业造成危害，迄今仍无有效的疫 苗予以预防。我国目前还不是该病毒的疫区，但研制有效疫苗预防该病仍有一定必要。灭 活疫苗免疫的动物，抗体产生速度慢，需反复接种，不适合在疫情出现时应急免疫之用，且 通常难以有效激发CD8T细胞介导的细胞毒性T细胞反应（CTL)及粘膜免疫应答。利用减 毒活疫苗是克服这些困难的有效方法之一。目前应用于猪的病毒疫苗载体主要包括腺病毒和伪狂犬病毒，均属于DNA 病毒。水泡性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus,VSV)则是一种新型RNA病毒载体， 属于弹状病毒科，其天然宿主为猪和牛等家畜动物，基因组是一条单链负义RNA分子，长度 约为llkb，由5个基因组成，分别编码病毒的核衣壳蛋白（N)、磷酸化蛋白（M)、囊膜蛋白 (G)和病毒RNA复制酶（L)，其中VSVG蛋白负责识别病毒受体并介导病毒入侵宿主细胞， 它决定了病毒的嗜性。1996年，JohnRose课题组建立了VSV的体外挽救（rescue)技术 ，为研制新型水泡性口炎病毒载体提供了新的思路。VSV病毒载体的优势在于：1.载体 基因组中可插入多个外源基因同时进行高效表达，并可激发机体产生全面的免疫保护力， 尤其是细胞免疫和粘膜免疫；2.繁殖速度快，易于大规模培养。 近年来，WHO等国际组织提出要发展一种理想疫苗，使其具有安全、高效、多价、应 用方便等特点，基于致弱病毒的活载体疫苗是一个方向，因为病毒载体表达的外源抗原可 高效和全面地激发机体免疫应答。弱化病毒的获取通常有几种方法，（1)自然弱化的病毒 株，如麻疹病毒的Edmonson株；(2)经非天然宿主动物或细胞反复传代致弱，如痘苗病毒安 卡拉株（MVA)是野毒经鸡胚成纤维细胞（CEF)传代570次以上得到的高度致弱毒株；近年 来，利用基因工程技术对野生型病毒进行人工弱化正在成为趋势，主要策略包括：（1)假型 化改造（pseudotyping)，即改变病毒天然嗜性，如利用VSV病毒载体表达Ebola病毒囊膜 蛋白开发的人用疫苗 ; (2)利用特定细胞中活化的启动子，如在肿瘤细胞中具有高活性 的端粒酶基因启动子（telemerasepromoter)去控制病毒复制必须基因，使得病毒只能在 特定细胞如肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中不复制，从而达到减毒目的；（3)利用组织特 异性表达的MicroRNA分子为减低病毒的毒性提供了新途径。MicroRNA是一类具有组织表 达特异性的转录后调控分子，不同的MicroRNA在不同组织中的分布存在差异，如Stephen Russell等利用肌肉组织特异性miR133a识别序列开发的柯萨奇病毒载体，去除了野生型 病毒对肌肉组织的毒性。VSV是一种有前途的病毒载体，具有很多的优点，但野生型VSV所存在的毒性 限制了其临床运用，有必要加以该进，去除其致病性。在之前的研究中，参见中国专利 CN201410029722.X，公开了一株基质蛋白突变的重组水泡性口炎病毒作为猪用疫苗载体； 所述疫苗载体为重组病毒VSVAM51，该病毒的基质蛋白（M)的第51位氨基酸甲硫氨酸被敲 除。并在国内外首次对VSVAM51在猪上的致病性进行了较为系统的评估，为VSVAM51作 为疫苗载体提供了证据。但是，从其结果来看，虽然VSVAM51较野生型VSV病毒已有一定 程度的弱化，但是仍表现出一定的致病性，仍需进一步地改造以提高其安全性。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一株基质蛋白（M)三氨基酸位点突 变的新型猪用水泡性口炎病毒，通过对重组病毒VSVAM51进一步改造，获得致病性极低， 安全性高，并且能有效激发机体产生保护性免疫应答反应，具有良好的应用前景的新型猪 用水泡性口炎病毒载体。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： 本专利技术提供了一种猪用水泡性口炎病毒疫苗载体，所述疫苗载体为基质蛋白（M) 三氨基酸位点突变的重组病毒VSV-Mt，该病毒M蛋白的第51位甲硫氨酸被敲除，第221位 缬氨酸突变为苯丙氨酸，第226位甘氨酸突变为精氨酸。 本专利技术还提供了一种猪用水泡性口炎病毒载体的构建方法，包括以下步骤： S1、三氨基酸位点发生突变的VSVM基因（Mt)的制备：以pVSVAM51质粒为PCR 扩增模板，采用重叠PCR(OverlappingPCR)方法对M蛋白221和226位氨基酸进行定点突 变，得到Mt。 52、？￥3￥-]\11质粒构建：对31获得的]\1 1经乂&31和組111双酶切后克隆到？￥3￥&]\151 质粒，获得PVSV-Mt质粒。S3、M蛋白三位点突变的VSV(VSV-Mt)病毒的构建：用表达T7RNA聚合酶的痘病 毒VTF7-3感染BHK-21细胞并孵；同时制备质粒转染混合液，其中包括质粒pBS-N、pBS-P、 pBS-L及pVSV-MT，按Invitrogen公司的Lipofectamine2000所提供的转染方法将质粒进 行转染；转染后吸取上清，滤去痘病毒，将滤液加入到对数生长期的BHK-21细胞中，待细胞 出现病变情况，收集上清，进行病毒鉴定即得。 优选地，所述步骤一中，重叠PCR方法所需4条引物设计为：引物1如SEQIDNo. 1 所示，引物2如SEQIDNo. 2所示，引物3如SEQIDNo. 3所示，引物4如SEQIDNo. 4所 不。 优选地，所述的重叠PCR方法为先用引物1与引物2扩增出片段1，引物3和引物 4扩增出片段2,用胶回收试剂盒回收片段1和片段2,DNA定量后按1:1比例混合以上2片 段并作为模板，再用引物1和引物4进行第二轮PCR。 优选地，所述片段1大小应为871bp，包含M蛋白基因的上游部分和部分P蛋白基 因；所述片段2大小应为179bp，包含M蛋白基因的下游部分；所述片段1与片段2有50bp 的重叠序列。 优选地，所述引物1上具有XbaI酶切位点，引物4上具有MluI酶切位点。 优选地，所述S3中，痘病毒VTF7-3感染BHK-21细胞的接种量为MOI= 5,孵育时 间为1小时。 优选地，所述S3中，转染时间为48h。 优选地，所述S3中，用0. 22ym的滤膜滤去痘病毒。 本专利技术还提供了 一株猪用水泡性口炎病毒载体备病毒疫苗或疫苗载 体中的用途。 本专利技术首次构建了一株新型重组水泡性口炎病毒，该病毒基质蛋白（Matrix,M) 三个不同氨基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪用水泡性口炎病毒载体，其特征在于，所述载体为M蛋白三氨基酸位点发生突变的重组病毒VSV‑MT，所述M蛋白的第51位甲硫氨酸被敲除,第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸，第226位甘氨酸突变为精氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙涛，肖贤，方心葵，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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