反向遗传系统技术方案

本发明专利技术提供各种用于生产分段RNA病毒的反向遗传系统，其中所述系统不需要细菌增殖其所有表达构建体。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是2010. 07. 30提交的CN201080041918. 0,题为"反向遗传系统"的分案申 请。 本专利申请要求2009年7月31日提交的美国临时专利申请61/273, 151号的优 先权，其全部内容通过引用纳入本文。
本专利技术涉及反向遗传领域。此外，其涉及制备病毒，所述病毒例如用于制造防御各 种病毒的疫苗。
技术介绍
反向遗传可在细胞培养中重组表达和操作病毒。它是病毒学和疫苗制造的有效工 具，因为能快速生产和突变病毒，包括重排列生产。所述方法涉及用一种或多种编码所述病 毒基因组的质粒转染宿主细胞然后从所述细胞中分离（或"拯救"）所述病毒。其可用于生 产各种RNA病毒，包括正链RNA病毒，负链RNA病毒和双链RNA病毒。 已知方法的缺陷在于其依赖质粒。产生这些质粒需要在细菌中进行克隆步骤，这 需要数天或数周来形成和验证分段RNA病毒。这种延迟干扰了季节性流感疫苗的年度生产 时间表并阻止了对大流行爆发的快速响应。此外，所述质粒用于转染宿主细胞生产病毒时， 使用细菌导致引入细菌污染物的风险。这些缺点在参考文献6中通过使用线性表达构建体 代替质粒来处理。所述线性表达构建体不含在细菌增殖中使用的扩增和/或选择序列，且 几乎总是造成病毒准种的单一代表的分子克隆。该线性表达构建体可用于直接转染宿主细 胞，产生更快的反向遗传系统：参考文献6提示所述线性构建体的转染可在收到病毒分离 物后数小时内实现，避免分子克隆所需要的时间并可接触原始病毒准种群体的有用成员。
技术实现思路
对于分段病毒，参考文献6中使用的方法每病毒区段用一种线性构建体。因此本 方法的反向遗传病毒生产需要用八种不同的构建体转染宿主细胞。本专利技术的目的是避免使 用该多重转染。更一般地，本专利技术的目的是进一步提供和改善对分段RNA病毒实施反向遗 传的方法，具体地是进一步提供不需要使用细菌的方法。本专利技术提供各种用于生产分段RNA 病毒的反向遗传系统，其中所述系统不需要细菌增殖其所有表达构建体。理想地，完全不需 要细菌。 在第一方面，反向遗传系统基于编码至少两种病毒基因组区段的非细菌表达构建 体。该系统降低需转染到宿主细胞中用于生产完整病毒基因组的构建体数量。例如，单一 构建体可用于编码8种流感病毒区段，因此转染复杂性比参考文献6降低8倍。因此本发 明提供非细菌表达构建体，所述构建体含表达分段RNA病毒的至少两种不同基因组区段的 编码序列。本专利技术还提供包含所述非细菌表达构建体的真核宿主细胞。本专利技术还提供两种 或多种该非细菌表达构建体集合，其中所述集合编码完整分段RNA病毒基因组。 在第二方面，反向遗传系统基于⑴至少一种细菌表达构建体和（ii)至少一种非 细菌表达构建的组合。这两种类型的构建体各提供至少一种病毒基因组区段。尽管本方面 不能完全避免使用细菌制备所述系统，但其仍非常有效。例如，利用可获得的各种方便的分 子生物学技术，表达所述病毒区段的子集的构建体可在细菌中增殖并操纵。该子集的区段 可为那些通常不需要在株系之间变化的区段。剩余病毒区段可由非细菌表达构建体编码， 且这些构建体可在短时间内快速制备而不需要细菌工作。因此该组合表示可在短时间内将 注意力集中于感兴趣的区段，且所述构建体可与已获得的已有"背景"区段组结合。因此本 专利技术提供表达构建体集合，所述集合含（i)至少一种含分段RNA病毒的一种或更多基因组 区段的编码序列的质粒和（ii)至少一种含所述RNA病毒的一种或多种基因组区段编码序 列的非细菌表达构建体，其中细菌和非细菌构建体的组合提供所述RNA病毒的至少两种不 同基因组区段。本专利技术还提供包含所述构建体集合的真核宿主细胞。 第三方面，本专利技术提供含线性表达构建体的宿主细胞，所述构建体含分段RNA病 毒的至少两种不同基因组区段的编码序列。所述细胞可为细菌但优选真核细胞。 第四方面，本专利技术提供含流感病毒的8种不同基因组区段的编码序列的细菌质 粒，其中各区段的表达受到（i)哺乳动物pol-I启动子或（ii)噬菌体聚合酶启动子的控 制。本专利技术还提供含所述构建体的细胞，该细胞可为细菌或真核细胞。 本专利技术还提供制备本专利技术宿主细胞的方法，所述方法包括将上述一种或多种表达 构建体插入所述细胞的步骤。 本专利技术还提供在本专利技术的真核宿主细胞中表达RNA的方法，所述方法包括在从所 述表达构建体发生所述RNA病毒区段表达的条件下培养所述宿主细胞的步骤。 本专利技术还提供了生产分段RNA病毒的方法，所述方法包括在从所述表达构建体发 生所述RNA病毒区段表达的条件下培养所述宿主细胞的步骤以生产所述病毒。然后从所述 宿主细胞或所述宿主细胞的培养物中纯化所述方法生产的病毒。本专利技术还提供了通过此方 法得到的病毒。所述病毒可用于感染蛋或细胞以培养病毒用于疫苗制造。因此本专利技术提供 制备病毒疫苗的方法，所述方法包括用本专利技术的病毒感染培养宿主（如蛋或细胞）、培养所 述病毒、然后从所培养的病毒中制备疫苗。 本专利技术还提供制备DNA分子的方法，所述分子含表达分段RNA病毒基因组的至少 两种不同区段编码序列（如本专利技术的非细菌表达构建体），其中至少部分所述DNA通过化学 方法制备。 本专利技术还提供制备DNA分子的方法，所述分子含表达分段RNA病毒基因组的至少 两种不同区段编码序列（如本专利技术的非细菌表达构建体），其中所述方法包括步骤：（i)合 成所述DNA分子的多种重叠片段，其中所述重叠片段跨越所述完整DNA分子；和（ii)连接 所述片段以提供所述DNA分子。然后可回收所述DNA分子并用于本专利技术的反向遗传方法，如 其可插入真核细胞用于产生所述分段RNA病毒。所述DNA分子在回收和插入所述真核细胞 之间优选不插入细菌细胞，即所述构建体直接用于病毒拯救而不用任何中间的细菌扩增。 本专利技术还提供分段RNA病毒的表达构建体库，其中各表达构建体含所述病毒的至 少一种基因组区段的编码序列。所述库包括所述基因组的各区段至少一种构建体，从而所 述完整基因组可被选择所述库的子集所代表。一些病毒区段可比其他更通常地代表，如流 感病毒库可包括比平均更多的HA和NA区段。为了构建所需的感兴趣的病毒基因组，选择 编码各所需区段的库成员然后表达以产生所需的病毒。所述库对流感病毒更有效，通过允 许骨架基因组区段与感兴趣的HA和NA区段的快速重配以产生有用的病毒用于疫苗生产。 非细菌表达构建体 本专利技术的所述第一、第二和第三方面利用一种或多种"非细菌表达构建体"。该术 语表示所述构建体可在真核细胞中驱动其内编码的病毒RNA区段的表达，但其不包括用于 所述构建体在细菌中增殖所需的组分。因此所述构建体不含细菌复制起点（〇ri)，且通常不 含细菌选择标记（如抗生素抗性标记）。真核宿主细胞中驱动所需的病毒RNA表达不需要 这些组分，所以不用细菌增殖所述构建体时其多余。没有这些增殖组分表明所述构建体导 入细菌中不会复制。 所述非细菌构建体可为线性或环形。线性构建体更常用（如参考文献6中所示）， 但也可使用环形构建体。环形构建体可通过环化线性构建体制成，反之亦然。所述环化方 法如参考文献6所述。环形构建体的线性化可用各种容易的方法实现，如利用一种或多种 限制性内切酶，或通过用核酸扩增技术（如PCR)从模板（包括环形本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非细菌表达构建体，所述构建体含表达分段RNA病毒的至少两种不同基因组区段的编码序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P·道米策，M·弗兰蒂，P·马森，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH