一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法及其临床应用技术

本发明专利技术提供一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法，其中，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞；体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124表达，抑制了其靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力，体内实验中抑制胶质瘤的生长和转移复发；本发明专利技术还提供了过表达BDNF的间充质干细胞及其治疗胶质瘤的临床应用，该间充质干细胞将能抑制胶质瘤生长，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的方法以及通过所述方法获得过表达BDNF的间充质干细胞，特别地，本专利技术涉及的过表达BDNF的间充质干细胞体外实验中启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124的表达，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力，体内实验中抑制了胶质瘤的生长和转移；本专利技术的过表达BDNF的间充质干细胞可以用于临床治疗胶质瘤，针对性地抑制胶质瘤生长，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。
技术介绍
胶质瘤的发病是一个多因素、多步骤的、多种癌基因和/或抑癌基因参与的协同积累的过程。迄今为止，传统的手术、放疗、化疗等治疗方法治愈率仍然很低，肿瘤复发率高，预后极差。传统的胶质瘤治疗主要作用于肿瘤的实体，其疗效有限，胶质瘤本身的复发转移的能力使得手术后肿瘤再次生长和转移。原因是肿瘤本质上具有抵抗化学疗法和放射治疗的能力或在治疗过程中获得此种能力。而执行这一能力的可能是胶质瘤干细胞(Glioma stem cells，GSC)，其中的机制包括自噬作用、环氧化酶-2依赖的炎症反应、抑制凋亡、ATP结合转运蛋白的外排功能、Notch信号通路介导作用、DNA损伤修复反应。针对胶质瘤干细胞靶向治疗目前研发一些治疗手段，如通过靶向GSC杀伤可以逆转肿瘤放化疗抵抗，提高放化疗的敏感性；针对血管或内皮细胞的抗血管微环境的治疗，均能干扰肿瘤干细胞微环境的功能，在抑制肿瘤生长的同时还消弱了肿瘤的根本；可以识别和清除GSCs的免疫细胞治疗，也为抗胶质瘤治疗提供新的思路。本专利技术提供了一种在胶质瘤中低表达的微小核糖核酸124(microRNA-124，miR-124)，造成胶质瘤干细胞增殖和成球生长，使得胶质瘤生长和转移复发。然而，提高miR-124在胶质瘤中的表达，抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长，引起胶质瘤缩小和抑制转移与复发。本专利技术以人间充质干细胞作为载体过表达脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，能有效地启动胶质瘤干细胞中miR-124的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长，抑制胶质瘤的生长与转移复发。人间充质干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产，是基因表达理想的载体，因而，本专利技术抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞制备简单，能个体化临床治疗胶质瘤患者，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗胶质瘤。
技术实现思路
胶质母细胞瘤高度不均一性，分为三个等级，最高级的是肿瘤干细胞，位于塔顶，接下来是分化阶段的肿瘤祖细胞，位于塔底的是已分化的大量肿瘤细胞。现在的治疗往往针对的是肿瘤实体中的分化细胞，而忽视了前两种细胞，虽然这些干细胞只占胶质母细胞瘤的很小一部分，但很可能负责肿瘤的起源和生长，侵袭和复发及远处播散。胶质瘤干细胞具有下列特性：自我更新、无限增殖、多向分化潜能、表达神经干细胞的标志物、培养于干细胞培养基中能形成细胞球、极小数量接种于免疫缺陷小鼠颅内能独立成瘤。GSCs的起源至今未明，可能来源于遗传或表观遗传突变的神经干细胞或祖细胞，或者星形胶质细胞经过一系列的突变或重新编程而来。GSCs比一般细胞对放射治疗和化学治疗更加耐受。GSCs的这些特性被视为是胶质母细胞瘤恶性表型和术后复发的根源，GSCs是胶质母细胞瘤的“种子细胞”，针对GSCs的研究或治疗更能模拟胶质母细胞瘤的真实情况，可见GSCs已成为研究治疗脑胶质母细胞瘤的新工具。本专利技术是我们长期通过基础研究的科研成果，发现miR-124在胶质瘤发生发展中发挥着重要作用，是胶质瘤干细胞赖以生存的抑制分子。我们研究发现miR-124可通过靶向多个基因，包括白介素6(interleukin 6，IL-6)信号通路中的一个已知元件信号传导与转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，白介素1(IL-1)信号通路中的一个已知元件核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，以及白介素8(IL-8)信号调控因子蛋白激酶B((serine/threonrine kinase，Akt)等，IL-6、IL-1和IL-8信号可能刺激GSCs的生长和生存，其受体和糖蛋白优先表达于GSCs，阻断其受体或干扰炎性分子的表达能抑制GSCs的增殖达到阻碍肿瘤的生长及延长荷GSCs来源的胶质瘤鼠的生存期及明显消弱了GSCs的增殖能力。在人类胶质瘤细胞中缺氧可导致miR-124下调，从而使得STAT3、NF-κB和Akt激活，促使人类胶质瘤干细胞的自我更新、增殖和侵袭能力。本专利技术通过研究发现了BDNF可以与胶质瘤干细胞膜上BDNF受体结合激活环腺苷酸反应元件结合蛋白1(cyclic AMP-response element binding proteinl，CREB1)的表达，miR-124启动子中存在着CREB1结合域，通过CREB1与miR-124启动子域结合活化miR-124表达，高表达的miR-124可以靶向作用于STAT3、NF-κB和Akt，抑制其的激活，从而影响炎性分子IL-6、IL-1和IL-8信号刺激的GSCs生长和生存，同时也干扰了IL-6、IL-1和IL-8等炎性分子的分泌，阻断了GSCs自分泌刺激机制，抑制了GSCs的增殖和自我更新能力，导致阻止了胶质瘤生长与转移复发。本专利技术提供了一种抑制胶质瘤生长的BDNF4过表达间充质干细胞的制备方法，其中，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞。BDNF基因片段通过正常组织中DNA聚合酶链式反应(DNA polymerase chain reaction，PCR)扩增或者化学合成法获得，经酶切位点连接到病毒载体上，包装到病毒表达系统上后转染人间充质干细胞，获得过表达BDNF的间充质干细胞。人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSC)具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、神经、内皮等多种组织细胞。本专利技术利用其干细胞归巢趋化功能，可以定向迁移到脑部受损的部位，发挥着神经细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞；体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中microRNA‑124表达，抑制miR‑124靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力；体内实验中抑制胶质瘤的生长和转移复发。

【技术特征摘要】
1.一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法，其
特征在于，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转
染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞；体外实验中与胶质
瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124表达，抑制miR-124
靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生
长能力；体内实验中抑制胶质瘤的生长和转移复发。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过正常组织中PCR
扩增或者化学合成BDNF基因片段，经酶切位点连接到病毒载体上，包装到
病毒表达系统上后转染人间充质干细胞，获得过表达BDNF的间充质干细胞。
3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述间充质
干细胞来源人废弃脐带、胎盘、自体骨髓或自体脂肪组织；优选地，来源于人
自体骨髓。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述病毒表
达系统为慢病毒系统、腺病毒系统、逆转录病毒系统；优选地，选择慢病毒表
达系统。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述过表达
BDNF的间充质干细胞，体外与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中
microRNA-124的表达，其靶基因STAT3、Akt和RelA表达显著下降，使得胶
质瘤干细胞增殖能力和成球生长能力明显地降低。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述过表达
BDNF的间充质干细胞，在动物体内杀瘤试验中促使了胶质瘤中
microRNA-124的表达，使得其靶基因STAT3、Akt和RelA表达显著下降，炎
性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌也明显降低，使得胶质瘤大小显著缩小并且转
移明显得到抑制。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，BDNF基因
片段通过正常组织中PCR扩增或者化学合成法获得，引入双酶切位点连接到
病毒载体上，取对数生长期的293T细胞，以(2～2.5)×106细胞数接种于10cm

\t的细胞培养皿中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，细胞融合度为
60％～80％时利用LipofectamineTM2000转染进行病毒包装；转染分为2组：阳
性组和对照组；48～72小时后收集病毒上清液，4℃、3000r/min离心5分钟后，
用直径为0.45μm的滤膜过滤分装，用于细胞感染；将两组病毒上清分别感染
人间充质干细胞，同时加入工作液浓度为5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，
次日去除含病毒的培养基，更换为DMEM/F12完全培养基，感染后72小时荧
光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP
显色超过90％以上，表明携带BDNF目的基因病毒转染人间充质干细胞成功，
获得过表达BDNF的间充质干细胞。
8.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，
以基因组DNA为模板PCR扩增BDNF，将pFU-GW载体Xba I和Hpa I双酶切
后，在T4DNA连...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爽，
申请(专利权)人：刘爽，
类型：发明
国别省市：北京;11