本发明专利技术提供了一种构建体，其包含(i)编码酪氨酸羟化酶(TH)的核苷酸序列，(ii)编码GTP-环化水解酶I(CH1)的核苷酸序列和(iii)编码芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)的核苷酸序列，其中编码TH的核苷酸序列与编码CH1的核苷酸序列相连，使得它们编码融合蛋白TH-CH1。本发明专利技术还提供了包含所述核苷酸序列的病毒载体以及其在治疗和/或预防帕金森氏病中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】构建体专利
本专利技术涉及一种包含编码参与多巴胺合成途径的酶活性的核苷酸序列的构建体。可操作地连接至少两条核苷酸序列使得它们编码一种融合蛋白。本专利技术也提供包含所述核苷酸序列的病毒载体基因组、载体生产系统和病毒载体颗粒。核苷酸序列在体内的表达，例如通过使用病毒载体颗粒的基因治疗，导致多巴胺的合成，这在治疗和/或预防以产生多巴胺的神经元的减少或损失为特征的神经系统疾病，如帕金森氏(Parkinson’ s disease)病中是有用的。专利技术背景帕金森氏病(PD)是一种神经变性疾病，其是以黑质区产多巴胺的神经元的损失为特征的。这最终导 致在纹状体中多巴胺的耗竭，引起严重的运动障碍。帕金森氏病的一种治疗方法是口服给药L-D0PA，即多巴胺的前体，这可以恢复一定程度的运动功能。然而，随着病情的发展，在运动障碍的治疗中L-DOPA治疗变得不那么有效，需要使用更高的剂量，这具有严重的副作用。可以通过将多巴胺直接释放到纹状体来实现ro的改善治疗。这可以通过基因治疗来实现。基因治疗对于ro治疗是有吸引力的，因为特定蛋白质的产生可以靶向cns(中枢神经系统)的特定区域，如纹状体。从氨基酸酪氨酸的多巴胺合成涉及酶酪氨酸羟化酶(TH)，其催化从酪氨酸的L-DOPA合成，和芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)，其将L-DOPA转化为多巴胺。TH步骤被认为是限速的。TH发挥功能需要辅因子四氢生物蝶呤(BH4)，其合成是由酶GTP-环化水解酶I (CH-1)催化的。在ro动物模型中，已经研究了使用腺伴随病毒(AAV)载体从多巴胺生物合成途径递送单一基因的基因治疗方法具有一些行为益处(Leff等人，1999Neuroscience92，185-196 ；Bankiewicz 等人，2006Mol Therl4，564-570)。进一步的方法表明，在 PD 动物模型中同时递送两种或更多种介导多巴胺合成的酶表现出更大的功效(Fan等人，1998HumGene Ther9, 2527-2535.;Shen 等人，2000Hum Gene Therll, 1509-1519.;Muramatsu 等人，2002Hum Gene Ther13,345-354)。这导致了以下理论，如果所有三种多巴胺合成酶共同并在同一细胞中表达，那么多巴胺合成会更高，并会导致在ro中更有效。然而，由于AAV载体有限的包装能力，可以被递送的基因数量是有限的。因此，决定使用慢病毒载体(LV)用于此目的，因为这些载体的包装容量要大得多。因为它们稳定转导非分裂细胞类型，例如神经元的能力，慢病毒载体(LV)用于对中枢神经系统(CNS)的基因治疗方法是特别有利的。已经开发了衍生自非灵长类慢病毒的，尚未知道对于人类是感染性或病原性的LV，如马传染性贫血病毒(EIAV)，而且确定了其转导非分裂细胞的能力。PiOSmdn?是一种用于ro治疗的基于马传染性贫血病毒(EIAV)的lv。ProSavin?的基因组是三顺反子构建体,其包含由两个内部核糖体进入位点(IRES)可操作地连接的三种关键的多巴胺合成酶，即TH、AADC和CHl的编码序列。目前ProSavinit正在Ι/II期临床试验中进行评估，其中使用在包括三种质粒瞬时共转染HEK293T 细胞的流程中产生的载体材料(Mitrophanous 等人，1999Gene Ther6,1808-1818)。任何基因治疗方法的一个目标是提高载体的滴度，从而能使用体积更小的载体制备物。这在PraSavinfc型治疗中是特别理想的结果，其中将所述载体直接注射到脑中，因此需要使用小体积。IRES元件的复杂二级结构可能成为有效逆转录的阻碍。因此，本专利技术人假设IRES元件的去除应该增加载体的滴度。其中一个方案是以编码短肽序列(接头)的序列取代IRES元件以产生包含多巴胺合成所需的三种酶活性中的两种或更多种的融合蛋白。然而，因为TH的天然形式以同源四聚体存在(Goodwill等人，1997Nat Struct Biol4，578-585)，而CHl的天然形式以同源十聚体存在(Nar等人，1995Structure3,459-466 ；Steinmetz等人，1998J Mol Biol279，189-199)，这些酶彼此或与其它酶，如AADC的融合可能阻止了酶的正确的三级结构形成，然后这可能抑制酶的功能或阻止其以最大的能力发挥功能。支持这一点，先前已经报道，TH和β-半乳糖苷酶之间的融合是无酶活性的(Wu和C印ko (1994)，J Neurochem62:863-72)。令人惊奇的是，本专利技术人发现对于导致升高的L-DOPA和/或多巴胺产生水平的一些构建体，两种或全部三种多巴胺合成酶的融合导致i)功能性酶；和ii)增强的多巴胺生物合成途径。特别的是，与使用具有以IRES序列分隔的编码多巴胺合成酶的全部三种基因的构建体获得的水平相比时，对于一些构建体观察到增强的多巴胺的产生。与预期相反，对于许多构建体，这些融合设计带来的改善与载体滴度的增加设査关联，表明IRES序列对滴度不具有抑制作用。此外，L-DOPA和多巴胺升高的水平并不是由于来自融合设计载体的蛋白表达的增加引起的，表明融合设计具有更高的比活性。 【附图说明】图1-编码多巴胺酶融合体的基因组的示意图。图2-pONYK-TAiC的载体产量和HEK293T细胞中整合的载体的儿茶酚胺产量a) DNA整合分析评估载体滴度的结果b)HPLC分析评估儿茶酚胺产量的结果。图3-载体和儿茶酚胺产量a) DNA整合分析评估载体滴度的结果b)HPLC分析评估HEK293T细胞中产量的结果。图4-通过western印迹分析检测产多巴胺通路中的蛋白。图5-五个融合构建体的载体和儿茶酚胺产量a) DNA整合分析评估载体滴度的结果b)HPLC分析评估HEK293T细胞中儿茶酚胺产量的结果。图6-通过western印迹分析检测产多巴胺通路中的蛋白。a) Western印迹分析检测TH的表达b) Western印迹分析检测CHl的表达c) Western印迹分析检测AADC的表达。图7-显示TH的截短形式通过GS15接头与AADC连接的图。图8-通过western印迹分析检测HEK293T转导细胞的产多巴胺通路中的蛋白。a) Western印迹分析检测TH的表达b) Western印迹分析检测CHl的表达c) Western印迹分析检测AADC的表达。*TH融合CHl的正确条带的大小为68kDa，而且虽然在这些泳道中可以看到条带，在这个大小在所有其它泳道中存在一条非特异性条带。然而，条带在强度上比非特异性条带更暗。图9-DNA整合分析评估未浓缩和浓缩的融合载体制备物的载体滴度的结果。图10-以MOIl用EIAV载体转导的纹状体神经元a)经EIAV-GFP转导的纹状体神经元(MOIl)b)经载体转导的纹状体神经元的儿茶酚胺产量。图1l-TCiAmod的载体产量和整合的载体的儿茶酚胺产量a) DNA整合分析评估载体滴度的结果b)HPLC分析评估HEK293T细胞中儿茶酚胺产量的结果。图12 -用pONYKl、融合体和GFP载体对人原代皮质神经元的转导a)来自以M0I2和10用EIAV-GFP载体转导的人原代皮质神经元的图像本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种构建体，其包含(i)编码酪氨酸羟化酶(TH)的核苷酸序列，(ii)编码GTP‑环化水解酶I(CH1)的核苷酸序列和(iii)编码芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)的核苷酸序列，其中编码TH的核苷酸序列与编码CH1的核苷酸序列相连，使得它们编码融合蛋白TH‑CH1。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.28 GB 1118636.8;2011.10.28 US 61/552,5811.一种构建体，其包含(i)编码酪氨酸羟化酶(TH)的核苷酸序列，(ii)编码GTP-环化水解酶I (CHl)的核苷酸序列和(iii)编码芳香族氨基酸多巴脱羧酶(AADC)的核苷酸序列，其中编码TH的核苷酸序列与编码CHl的核苷酸序列相连，使得它们编码融合蛋白TH-CHl。2.根据权利要求1所述的构建体，其选自:TH-L-CHl-壓JVADC ；AADC+TH+CH1 ；TH_l_CH1_l_AADC ;和TH_l_CH1_p_AADCL =接头编码序列， IRES =内部核糖体进入位点， P =启动子。3.根据权利要求2所述的构建体，其是TH+CH1_ikes_AADC。4.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其包含不是为人类使用而密码子优化的接头。5.根据权利要求1-3任一项所述的构建体，其包含含有如SEQID N0.1所示序列的接头。6.根据权利要求1或2所述的构建体，其具有序列AADC_u_TH+2_CH1或TH_u_AADC_u_CHl，其中LI和L2是两个不同的接头序列。7.根据权利要求6所述的构建体，其中LI和L2的核酸序列是不同的，但是LI和L2的氨基酸序列是相同的。8.根据权利要求7所述的构建体，其中LI和L2的核酸序列是不同的并选自SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.3。9.根据权利要求2所述的构建体，其具有序列TH+CH1_PJVADC，其中所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。10.根据权利要求9所述的构建体，其中所述启动子是组成型启动子，其是CMV启动子、磷酸甘油酸激酶启动子或胸苷激酶启动子。11.一种病毒载体基因组，其包含根据前述权利要求中任一项所述的构建体。12.根据权利要求11所述的病毒载体基因组，其是慢病毒载体基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：K米特罗范奥斯，S拉尔夫，H斯图尔德，A金斯曼，
申请(专利权)人：牛津生物医学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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