肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒及其拯救方法和应用技术

一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，拉丁文学名：(Human enterovirus 71 5’UTR chimeric virus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCC NO.V201524。非编码区的研究一直存在一个瓶颈问题，就是它无法像编码区的研究一样，可以通过构建表达载体进而表达出相应的蛋白进行研究。反向遗传技术为非编码区的研究提供了新的思路，我们构建的EV71的5’UTR区的嵌合毒株为研究EV71的5’UTR区在致病机制中的作用提供了研究平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒及其拯救方法和应用。
技术介绍
手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年在新西兰首次报道，1958年首次分离出柯萨奇病毒，并于1959年首次提出HFMD命名。早期发现的手足口病的病原体主要为CoxA16型，手足口病与EV71感染有关的报道开始于20世纪70年代初，1972年EV71首次在美国确认。此后EV71感染与CoxA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。其多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿病情进展较快，导致死亡。重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起。肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71抗体在成人血清中的阳性率达到65％以上，说明了这种病毒的广泛传播，每年春夏季温度升高时都会进入感染高峰期，流行趋势从散发逐渐趋于有小型聚集性爆发。手足口病的相关科研工作起步较晚，发达国家拥有较好的科研平台，亚太地区为主要流行区域，但对EV71的基础研究投入不够，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物，对EV71进行有效的预防和控制。由于肠道病毒71型属于小RNA病毒科，所以其基因组的人工操作较难，这给疫苗的制备增加了难度。因此目前对EV71的疫苗研究仍主要聚焦在传统的灭活疫苗上，而此类疫苗的免疫效果一般较低；虽然能够诱导产生包括中和抗体在内的免疫反应，但不能诱导细胞毒T淋巴细胞反应；诱导产生的免疫反应持续时间较短，需要多次接种；需要使用佐剂，制剂中存在灭活剂，灭活剂对病毒抗原有影响；由于诱导的免疫反应水平较低，以及各个抗原成分之间的疫苗应答不平衡，可能诱发疾病；一般不能通过自然途径接种，不易产生局部免疫反应。由于以上问题的存在，亟需研发新型疫苗，既能保留完整的免疫原性，有效刺激免疫应答，又能避免感染性。此类疫苗的研制，需要对病毒基因组中各基因编码区域的功能进行深入研究和了解，这种深入了解还有助于筛选抗病毒药物的靶点研究。反向遗传学方法研究RNA病毒，是在质粒水平上来操作、研究RNA病毒，获得的拯救病毒表型稳定，操作方便，为EV71的深入研究提供了一个很好的基础平台。但迄今还没有合适的病毒作为疫苗研究的工具。现有技术中没有研究者做EV71拯救病毒的，主要是存在技术偏见EV71的反向遗传学研究是无法实现的，此外由于EV71拯救病毒是一种新的病毒，所以在研究拯救方法时就存在很大的不可预期性，如何克服这种不可预期性是现有技术中无法做到的。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒及其拯救方法和应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，拉丁文学名：(Humanenterovirus715’UTRchimericvirus)，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCCNO.V201524。本专利技术病毒的形态特征描述：该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm，核酸为单股正链RNA。EV71型病毒基因组编码的四种结构蛋白VP1～VP4构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位，60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒的构建方法(模式图见图1)，步骤如下：(1)以SDLY1(GenBank，HM188481.1)全长cDNA为PCR模板，引物5’UTR1F(序列见表1，SEQIDNo.1)为上游引物，引物5’UTR1R(序列见表1，SEQIDNo.2)为下游引物扩增SDLY1株的5’UTR；(2)以SDLY107(GenBank，JX244186.1)全长cDNA为PCR模板，引物VP4107F(序列见表1，SEQIDNo.3)为上游引物，引物VP4107R(序列见表1，SEQIDNo.4)为下游引物扩增SDLY107的VP4；(3)采用融合PCR方法，以5’UTR1F(SEQIDNo.1)为上游引物，VP4107R(SEQIDNo.4)为下游引物将两个片段连接起来；(4)步骤(3)得到得融合片段以及pcDNA3.1(+)-SDLY107质粒(质粒pcDNA3.1(+)为本研究室保存，pcDNA3.1(+)-SDLY107构建见下图)进行HindIII和BsiWI双酶切，回收酶切片段后，利用T4连接酶进行连接获得重组病毒质粒pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)；(5)将步骤(4)得到的pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)进行质粒扩增、体外转录以及RNA转染。所述步骤(4)中酶切的具体步骤如下：HindIII与BsiWIFastDigestenzyme各2.5μL，DNA10μg，10×FastDigestGreenBuffer5μL，水补齐至50μl，37℃酶切3-4h。所述步骤(5)中具体为：RD细胞转染重组RNA后，37℃二氧化碳培养箱中培养以期病毒的拯救，通过每日观察细胞病变发现拯救病毒颗粒的出现，当CPE达到90％病变时，冻融一次(避免多次冻融)收获上清即为第一代拯救病毒；取第一代拯救病毒接种细胞培养板中(优选取500μl接种24孔细胞培养板中)，放入37℃二氧化碳培养箱中继续培养，培养3天后或出现明显的CPE时同样冻融一次(避免多次冻融)，10,000g离心5min收获上清，即为低二代拯救病毒；继续上述步骤接种二代病毒，约36h后出现病变，72h后病变达到90％，冻融三次收获病毒。反复操作传代3次以上直至细胞病变稳定即为拯救成功的病毒。pcDNA3.1(+)-SDLY107质粒构建过程如下：利用SDLY107株全基因组序列中固有的酶切位点(BsiWI,Bsp1407I),分三段扩增EV71全长基因组。构建见图2(1)根据SDLY107株全长cDNA作为扩增模板，以ORF107F为上游引物(序列见表1，SEQIDNo.5)，以ORF107R为下游引物(序列见表1，SEQIDNo.6)扩增EV71的大部开放阅读框(BsiWI—Bsp1407I)。将扩增片段ORF(BsiWI-Bsp1407I)与pcDNA3.1(+)质粒进行HindIII与XbaI双酶切。酶切片段回收后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，Human enterovirus 71 5’UTR chimeric virus，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015年6月24日，保藏编号：CCTCC NO.V201524。

【技术特征摘要】
1.一种肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒，Humanenterovirus715’UTRchimericvirus，保藏
于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学校内，保藏日期：2015
年6月24日，保藏编号：CCTCCNO.V201524。
2.如权利要求1所述的肠道病毒71型5’UTR嵌合病毒的拯救方法，其特征是，步骤如下：
(1)以SDLY1全长cDNA为模板，5’UTR1F为上游引物，5’UTR1R为下游引物扩
增SDLY1株的5’UTR；
(2)以SDLY107全长cDNA为模板，VP4107F为上游引物，VP4107R为下游引物
扩增SDLY107的VP4；
(3)以5’UTR1F为上游引物，VP4107R为下游引物将步骤(1)和步骤(2)得到的
两个片段连接起来；
(4)将步骤(3)得到的融合片段以及pcDNA3.1(+)-SDLY107质粒进行HindIII和BsiWI
双酶切，回收酶切片段后，利用T4连接酶进行连接获得重组病毒质粒pcDNA3.1(+)-107
(1-5’UTR)；
(5)将步骤(4)得到的pcDNA3.1(+)-107(1-5’UTR)进行质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：温红玲，郝树彬，孙乐乐，李静，乔乔，马英伟，庄志超，王志玉，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37