FKBP标记的重组水痘-带状疱疹病毒。为获得有效高滴度水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗，构建了水痘带状疱疹病毒开放阅读框4和48带有FKBP标记的病毒(VZV ORF4-48-FKBP)。用VZV ORF4-48-FKBP转染ARPE-19细胞后，当细胞培养液中，加FKBP合成配体(shield1)时，VZV ORF4-48-FKBP能够进行复制积累；如果细胞培养液中不加Shield1，病毒不能复制。表明Shield1可以调节带有FKBP标记病毒的复制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及FKBP标记的重组水痘带状疱疹病毒，特别是利用细菌人工人色体 (bacterial artificial chromosome，BAC)制备FKBP标记的重组水痘-带状疱疹病毒，还 有涉及制备FKBP标记的重组水痘-带状疱疹病毒的方法及包含能与水痘-带状疱疹病毒 基因组进行同源重组的片段。
技术介绍
水痘-带状疱疹病毒（Varicella-zoster virus，VZV)是水痘或带状疱疹的病原 体，几乎所有人于成年之前即接触过该病毒，90%的病例发生于10岁之前。VZV可引起两 种不同的病症，在儿童期，初次感染引起水痘，患水痘后机体产生特异性体液免疫和细胞免 疫，终身不再感染。但对长期潜伏于神经节中病毒不能被清除，当潜伏体内的病毒受到某些 刺激后复发则导致带状疱疹，多见于成年人和老年人。该病毒主要通过空气飞沫传播和接 触传染。 VZV是DNA病毒，含有125kb的碱基，编码70个开放读码框（open reading frames，ORFs)，其中，44个开放读码框是病毒增殖所必需的基因，26个开放读码框是病毒 增值非必需基因。 基因突变可以改变基因信息，基因突变为病毒疫苗的开发提供了极大方便。 Kazuhiro 等(Cloning of the varicella-zoster virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli)将VZV Oka株全基因组克隆至 BAC载体，病毒基因组可以在大肠杆菌及人胚肺细胞中增殖，BAC可被同事转化到人胚肺细 胞中的Cre酶精确切除，产生的VZV重组病毒具有亲本Oka同样的结构与特性；因此，细菌 人工人色体的发展，是病毒突变领域的一大突破，BAC可以克隆大片段病毒基因组。BAC克 隆的病毒可以在细菌细胞内保持稳定并可在细菌体内传播，在细菌细胞可以容易地操作病 毒基因组。任何要求的突变都可以在细菌细胞内轻松、快速地实现所需的突变，这种突变可 以在病毒重组前加以验证，然后才进行重组病毒；自从发展了这种构建重组病毒新方法，利 用这种BAC进行重组突变，使病毒疫苗及其基因组详细功能的研究取得了很大的进展。 Laura A. Banaszynski 等(Laura A. Banaszynski, Ling-chun Chen, Lystranne A. Maynard-Smith，A. G. Lisa Ooi，Thomas J. Wandless)利用一种表达在哺乳动物细胞时高 度不稳定，并能迅速降解的人FKBP12蛋白的突变体，分析病毒的增殖情况。利用这种方法， 构建重组病毒，对该病毒的感兴趣开放读码框（open reading frame，0RF)进行FKBP变异 的不稳定域（the destabilization domain of FKBP variant，daFKBP)进行标记，然后，在 该病毒培养过程中，加入一种能够渗透进入细胞的人工合成配体（synthetic ligand)叫做 Shieldl，合成配体Shieldl能够稳定不稳定域的融合蛋白，使重组病毒传播。如果培养病 毒的细胞中不加Shieldl，ddFKBP标记的融合蛋白快速降解，从而使病毒不能生长。这种标 记的ddFKBP为研究病毒基因的作用提供了一种强大的基因工具。 同源重组是基因重组的一种类型，是两个相同序列的DNA核苷酸之间进行交换。 野生型大肠杆菌对诱导外源DNA的同源重组是无效的，因为线性DNA通常被RecB⑶核酸外 切酶降解。为了克服这个问题，培育了 SWi02菌株，该菌株包含一个温度敏感的λ噬菌体 编码的一个暂时抑制RecB⑶(gam)的基因，以及两个基因（exo和beta)在同源重组过程 中进行双链的损伤修复。λ噬菌体对温度是敏感的（由于一个温度敏感λ cl抑制子的表 达），当细胞培养温度从32增加到42°C时，线性DNA的摄取和重组可以在几分钟之内完成。 这样当细菌细胞在32°C正常生长时，可以有几千个碱基对进行同源重组。另外改良的温度 敏感的λ噬菌体要求的同源重组：发生在同源序列相对较窄的一个区域内，因为BAC突变 体的建立通常是使用PCR扩增的基因序列，其两侧应为约40个碱基对与病毒DNA BAC序列 同源。 FKBP标记的重组水痘带状疱疹病毒，其开放阅读框0RF4和0RF48分别带有一个高 度不稳定域标记的人 FKBP12 蛋白（the destabilization domain of a highly unstable variant of the human FKBP12protein，ddFKBP)，ddFKBP标记蛋白可以被蛋白酶迅速降解。 在该病毒培养过程中，加入一种能够渗透进入哺乳动物细胞的人工合成配体（A synthetic ligand，shieldl)，该合成配体Shieldl能够稳定不稳定域的融合蛋白，使重组病毒传播。 如果培养病毒的细胞中不加Shieldl，ddFKBP标记的融合蛋白快速降解，从而使病毒不能 生长。如果培养病毒的细胞中有shieldl存在时，ddFKBP同时标记的0RF4和0RF48突变 株能复制；这种标记了 ddFKBP的病毒为研制高效价VZV疫苗提供了极大的方便。 已证实接种疫苗是控制水痘及带状疱疹的最有效措施，并且儿童接种一次即可获 得终身免疫。目前应用的水痘活疫苗的制备大多采用的是1983年被世界卫生组织（WHO)推 荐的Oka疫苗株，该疫苗株是日本学者高桥等人开发的（特公昭53-41202号）。1995年， 美国默沙东（Merck，Sharp&Dohme)公司用Oka株生产的水痘-带状疱疹减毒活疫苗（V-Oka 株）可用于未曾患过水痘的儿童和成人的免疫接种，用以预防水痘的感染和流行。但由于 Oka株疫苗自身制备过程中，经历了多次传代，其基因型有可能发生改变，并且Oka株本身 也可能具有遗传多样性。因此，为了保证疫苗的安全性和有效性，把传代10袋以内的病毒 作为疫苗。为了研制出优于Oka株，并经改变基因的水痘-带状疱疹减毒疫苗，有必要开发 FKBP标记的重组水痘-带状疱疹减毒及其制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是设计一种用FKBP标记的重组水痘带状疱疹病毒，其开放阅读框 0RF4和0RF48分别带有一个高度不稳定域标记的ddFKBP，ddFKBP标记蛋白可以被蛋白酶 迅速降解。但shieldl可与ddFKBP结合，阻止其降解。如果ddFKBP标记病毒在哺乳动物 细胞中进行增殖时，培养液有Shieldl存在，病毒能够进行复制。如果没有shieldl存在， 病毒不能复制；这样可以有效地控制病毒的复制、安全性和均质性。本专利技术的课题还在于为 了研制一种优于Oka株，并经过改变的水痘带状疱疹病毒疫苗，建立通过诱变生产重组水 痘带状疱疹病毒的方法。 本专利技术提供了生产FKBP标记的重组水痘带状疱疹病毒的方法，如利用携带大肠杆菌 人工染色体的Oka株生产FKBP标记的重组水痘带状疱疹病毒（即Oka株开放阅读框0RF4 和0RF48分别带有一个高度不稳定域标记的ddFKBP的病毒株）本文档来自技高网...
【技术保护点】
ddFKBP标记的重组水痘‑带状疱疹病毒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李淑英，张科，刘占军，杜军，李娟，朱丽华，李冀，刘爱华，
申请(专利权)人：河北联合大学，
类型：发明
国别省市：河北;13
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