本发明专利技术为新型生殖器疱疹疫苗，提供了一种经人源密码子优化的编码HSV‑2糖蛋白D的基因gD2，其序列为SEQ ID NO:1。还提供了一种上述gD2基因与截短的编码HSV‑2衣壳蛋白UL25的基因融合的基因gD2ΔUL25，其序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术还提供了分别包含上述两种基因的两种重组腺病毒、重组修饰的安卡拉株痘苗病毒和重组水痘－带状疱疹病毒以及其制备方法。还提供了所述两种基因以及重组病毒在制造用于预防和/或治疗由HSV‑2引起的病症(例如生殖器疱疹)的制剂中的用途。本发明专利技术还提供了一种联合疫苗，其含有灭活的HSV‑2病毒和上述重组病毒的不同组合。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗及免疫领域，具体涉及一种新型生殖器疱疹疫苗。
技术介绍
在全球范围内，生殖器疱疹(Genital Herpes，GH)已经成为最广泛的性传播疾病(STD)之一。生殖器疱疹主要发生于生殖器部位，由脓疱进而形成糜烂或溃疡，并且导致一系列并发症，如：疱疹性脑脊髓膜炎、脊髓脊神经根病、盆腔炎等。生殖器疱疹发病率高，亦可通过胎盘及产道感染新生儿，导致严重的新生儿后遗症甚至死亡，并且它与宫颈癌的发生相关，另外有研究表明GH能够增加HIV(人免疫缺陷病毒)的感染率，并能加速病情发展，引起严重的局部和播散性感染，因此，生殖器疱疹已经成为一个严重危害人类身心健康的公共卫生问题。单纯疱疹病毒(Herpes simplex Virus，HSV)是生殖器疱疹的主要病原体，HSV属于疱疹病毒科a病毒亚科，是双链DNA病毒。病毒颗粒呈球型，直径约为180-200nm，由核心、衣壳、包膜和被膜组成，病毒衣壳由162个病毒壳微体组成，主要由VP5、VP19、VP23、VP26四种蛋白组装而成，包膜由糖蛋白、脂质和聚多胺组成，目前已经发现的糖蛋白有11种，依次被命名为gB(glycoprotein B)、gC、gD、gE、gG……gM。病毒基因组由两个互相连接的长片段(L)和短片段(S)组成，L和S的两端有反向重复序列，编码至少84个ORFs(开放阅读框)。根据血清型可以把HSV分成两个型别：HSV-1和HSV-2，HSV-1主要引起口唇疱疹、咽炎、角膜结膜炎和散发性脑炎，HSV-2主要引起生殖器疱疹且与宫颈癌相关。HSV是一种典型的嗜神经病毒，主要通过性接触传播引起生殖器官的炎症和疱疹，初次感染多为隐性感染，初次感染后多转为潜伏感染，以非活化的状态存在于机体的神经节中，可在人体终生存在，当受外界因素刺激后引起复发，目前尚无特效药物控制HSV-2的感染和复发。因此研制有效的单纯疱疹病毒疫苗是防治疱疹病毒感染的理想方法。国内外研究较多的HSV-2疫苗按其作用机理和作用特点可分为灭活疫苗，减毒活疫苗、DISC(Disabled infectious single cycle，无感染性单周期)疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗等。现有的临床疫苗试验结果发现，体液免疫应答能降低病毒滴度，但是T细胞免疫对于抑制HSV复制、神经系统感染和复发感染有着至关重要的作用，采用病毒载体疫苗可以引起高强度的细胞免疫记忆，这些疫苗单独使用或作为加强疫苗使用时，可以产生明显的保护力提升。糖蛋白是HSV-2主要的免疫原，可诱导较强的体液和细胞免疫应答，大量研究指出HSV-2的11种糖蛋白中gD能诱导产生相对较高的中和抗体水平和CD4+T细胞增殖，另外，有文献表明衣壳蛋白UL25上具有多个表位能够激活CD8+T细胞应答，是未来疱疹疫苗的理想抗原候选。
技术实现思路
本专利技术提供了一种经人源密码子优化的编码HSV-2糖蛋白D的基因gD2，其序列为SEQ ID NO:1。本专利技术还提供了一种上述gD2基因与截短的编码HSV-2衣壳蛋白UL25的基因融合的基因gD2ΔUL25，其序列为SEQ ID NO:2。本专利技术还提供了分别包含上述两种基因的两种重组腺病毒rAd-gD2和rAd-gD2ΔUL25。所述两种重组腺病毒感染HEK293细胞后分别可高效地表达gD蛋白和gDΔUL25融合蛋白。经动物实验验证，专利技术人发现，所述两种重组腺病毒疫苗都产生了较好的对HSV的免疫效果。所述两种重组腺病毒是通过将上述两种基因使用Admax腺病毒包装系统(Microbix Biosystems Inc.)重组到复制缺陷型的5型腺病毒载体(E1和E3缺失)中而制备的，具体步骤包括：(1)将上述的序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基因插入到腺病毒穿梭载体中得到重组穿梭载体；(2)使用步骤(1)得到的重组穿梭载体与携带腺病毒基因的包装质粒共转染细胞，包装得到重组腺病毒。其中所述腺病毒穿梭载体为pDC316，所述细胞为HEK293细胞。本专利技术还提供了所述两种基因以及两种重组腺病毒在制造用于预防和/或治疗由HSV-2引起的病症(例如生殖器疱疹)的制剂中的用途。将灭活的HSV-2病毒与本专利技术的重组腺病毒rAd-gD2或rAd-gD2ΔUL25联合使用(初免-加强策略)产生了很好的HSV免疫效果。该联合免疫方案在初免后能够引起足够强度的细胞免疫记忆，产生针对单纯疱疹病毒的具有记忆性的T细胞，而加强的内源性的重组腺病毒载体疫苗中含有与初免疫苗相同的抗原表位信息，它再次进入机体，激活并特异性增殖存在于机体内的特异性的记忆性细胞，并在效应阶段产生足够强度的IFN-γ(γ-干扰素)等细胞因子，这极大地增强了疫苗保护力。两种疫苗联合使用，还可以避免针对载体本身的预存免疫，提升加强免疫效果。本专利技术还提供了分别包含所述基因gD2(SEQ ID NO:1)和gD2ΔUL25(SEQ ID NO:2)的两种重组修饰的安卡拉株痘苗病毒(MVA，Modified vaccinia virus Ankara)。在一个优选的实施方案中，所述重组MVA分别为MVA-gD2和MVA-gD2ΔUL25。所述重组MVA是将上述两种基因重组到MVA中而制备的，具体步骤包括：(1)将上述的序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基因插入到痘苗病毒穿梭载体中得到重组穿梭载体；(2)使用步骤(1)得到的重组穿梭载体转染已感染MVA的细胞，得到重组MVA疫苗。其中所述痘苗病毒穿梭载体为pSC11M1，所述细胞为BHK21-TK-细胞(痘苗病毒TK基因缺失)。本专利技术还提供了分别包含所述基因gD2(SEQ ID NO:1)和gD2ΔUL25(SEQ ID NO:2)的两种重组水痘－带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)。在一个优选的实施方案中，所述重组水痘－带状疱疹病毒分别为VZV-gD2和VZV-gD2ΔUL25。所述重组水痘－带状疱疹病毒是将上述两种基因重组到VZV Oka株中而制备的，具体步骤包括：(1)将载体pUSF-5与VZV Oka株共同电转至MRC-5细胞，通过绿色荧光蛋白筛选得到含有BAC(细菌人工染色体)的VZV Oka株VZV-BAC；(2)将上述的序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基因插入<本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种密码子优化的编码HSV‑2糖蛋白D的基因，其序列为SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
2013.12.05 CN 20131065336981.一种密码子优化的编码HSV-2糖蛋白D的基因，其序列为SEQ
ID NO:1。
2.一种权利要求1的基因与截短的编码HSV-2衣壳蛋白UL25的
基因融合的基因，其序列为SEQ ID NO:2。
3.一种重组腺病毒，其包含权利要求1或2的基因。
4.权利要求3的重组腺病毒，其为复制缺陷的5型腺病毒。
5.一种制备权利要求3或4的重组腺病毒的方法，包括如下步
骤：
(1)将权利要求1或2的基因插入到腺病毒穿梭载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜春来，孔维，刘微，
申请(专利权)人：长春百克生物科技股份公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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