本发明专利技术公开一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗（JDORF25）及制备方法和应用。本发明专利技术的鲫鱼疱疹病毒病疫苗为将鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫相关ORF25基因截短优化后翻译的重组蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。合成该基因片段，转入酵母表达载体，通过高拷贝克隆的筛选，最终获得了一株高表达的重组蛋白的巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25，CCTCC NO：M2014570。利用该酵母发酵生产的蛋白具备活性高，产量大的特点。通过免疫保护实验确定了该抗原蛋白能有效的预防鲫鱼疱疹病毒病，通过与佐剂混合使用能更有效的预防鲫鱼疱疹病毒病。
【技术实现步骤摘要】
一种鲫鱼疱疹病毒病JDORF25疫苗及制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗(JDORF25)及制备方法和应用。
技术介绍
鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ,CyHV-2)感染异育银鲫是近年新出现的一种严重病毒性疾病，已经造成重大经济损失。鲤疱疹病毒Ⅱ型最早在观赏金鱼中发现，称为“金鱼疱疹病毒性造血器官坏死症”。该病毒因其是第二个分离自鲤科鱼的疱疹病毒，国际病毒系统分类与命名委员会将其命名为鲤疱疹病毒II型(CyHV-2)。CyHV-2与鲤痘疮病毒(Carppoxherpesvirus,CyprinidherpesvirusⅠ,CyHV-1)及锦鲤疱疹病毒(Koiherpesvirus,Cyprinidherpesvirus3,CyHV-3)的关系接近，属于鲤疱疹病毒科成员，目前CyHV-2的全基因组测序与注释研究已经完成，对CyHV-2重要功能基因的研究正陆续展开，但对病毒疫苗制备方面研究相对较少。CyHV-2ORF25是一个重要的免疫相关基因，存在一个跨膜结构域，是制备预防鲫鱼疱疹病毒病疫苗的重要靶基因。本专利技术通过对鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25基因编码蛋白进行分析，选择亲水性和抗原性强的区域表达制备疫苗。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是一种新型真核表达系统，能稳定高效表达外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的蛋白的工业化生产提供了保障。自1984年应用毕赤酵母表达外源蛋白以来，已有400多种蛋白在该系统中成功表达，部分成果已进入商品化生产。由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为是该物种高表达基因的优越密码子，这种现象称为密码子偏爱性。密码子的偏爱性使得克隆的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白在该系统中的表达量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗，该疫苗为将鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫相关ORF25基因截短优化后翻译的重组蛋白JDORF25，其序列为SEQIDNO.2所示，对应的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术的另一个目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的制备方法，申请人提供了一株巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25PichiapastorisKm71/CyHV-2-25菌株，该菌株包含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，将该菌株发酵可制备鲫鱼疱疹病毒病疫苗。该菌株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCNO：M2014570，分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25PichiapastorisKm71/CyHV-2-25，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的最后一个目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗在制备鲤疱疹病毒Ⅱ型疫苗中的应用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的获得：分析Genbank公布的鲤疱疹病毒Ⅱ型免疫相关ORF25基因(JQ815364.1)，找到亲水性和抗原性强的区域，按酵母密码子偏好性进行优化，合成该基因片段，其序列为SEQIDNO.1所示，根据优化片段的基因序列设计引物(JDORF251F和JDORF251R)进行PCR反应，克隆获得截短优化的ORF25基因，转入酵母表达载体，获得重组表达载体，然后再将其导入酵母表达菌种，筛选高拷贝克隆，获得重组毕赤酵母表达菌，该菌株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCNO：M2014570，分类命名：巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25PichiapastorisKm71/CyHV-2-25，地址：中国武汉武汉大学。上述巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25PichiapastorisKm71/CyHV-2-25CCTCCNO：M2014570的菌学特征为：该酵母菌是单细胞真核生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单体，可在含有2mg/mLZeocin抗生素的YPDS平板上培养，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时。呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑、为乳白色。依次通过BMGY和BMMY培养基培养后，上清液中含有鲤疱疹病毒Ⅱ型JDORF25蛋白。上述巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25PichiapastorisKm71/CyHV-2-25的构建方法具体为：1)合成SEQIDNO.1所示为JDORF25基因的核苷酸序列。2)引物设计JDORF251F：5’-CGGAATTCCGACTCAAAACACTACTACTAC-3’(含EcoRⅠ酶切位点)JDORF251R：5’-TCCCCGCGGCGTTAGCACCGTATGGAGTAG-3’(含SacⅡ酶切位点)。3)PCR获取JDORF25基因以JDORF251F/JDORF251R为引物，优化合成的JDORF25基因为模板进行PCR，回收PCR产物。4)将获取的目的基因克隆入pPICZaB表达载体并进行序列测定PCR产物和pPICZaB均用EcoRⅠ、SacⅡ双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，从含25μg/mLZeocin的LB平板上挑取单克隆，小量提取质粒，用酵母特异引物5'-AOX(5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')和3'-AOX(5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')进行PCR鉴定，同时进行SacⅡ单酶切，EcoRⅠ、SacⅡ双酶切鉴定。阳性连接产物命名为：pPICZαB-CyHV-2-25。5)电转酵母菌及转化子的筛选重组质粒pPICZαB-CyHV-2-25经SacⅠ酶切线性化后，异丙醇沉淀回收，同时酶切空载体设为对照。酵母KM71感受态细胞的制备参考EasySelectPichiaexpressionkitusermanual,Invitrogen。将10μL线性化的重组质粒(约6μg)与80μL酵母感受态细胞混合，转移至预冷的0.2cm电转杯中，置冰上5min，1.5kV电击6.8毫秒后，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，30℃复苏2h，取菌液200μL涂布在含100μg/mLZeocin的YPDS平板上，30℃培养2～4天，直单克隆出现。从含有100μg/mLZeocin的YPDS抗性平板上随机挑取单克隆，按酵母基因组DNA提取试剂盒(OMEGA)操作说明提取重组酵母DNA进行PCR鉴定，所用引物为酵母通用引物AOXⅠ。对鉴定后的重组酵母-80℃保存，对鉴定后的重组酵母-80℃保存。转化子高拷贝筛选：取出冻存的阳性转化子，在无抗性的YPD液体培养中活化。将200μL菌液涂布于Zeocin抗生素浓度逐渐升高(0.5mg/mL，1mg/mL和2mg/mL)的YPDS平板上，30℃培养2～5d，每天观察菌落生长情况。挑取在高浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种分离的基因，其序列为SEQIDNO.1所示。2.含有权利要求1所述基因的毕赤酵母，所述的毕赤酵母为毕赤酵母Km71。3.一种分离的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为含有权利要求1所述基因的毕赤酵母Km71，其保藏编号为CCTCCNO：M2014570。4.权利要求3所述的基因工程菌制备的蛋白,蛋白序列为SEQIDNO.2所示。5.一种制备鲫鱼疱疹病毒病疫苗的方法，具体如下：将权利要求3所述的基因工程菌接种到100mLBMGY培养基中，30℃、250r/min振荡培养至OD600值达6左右，室温150...
【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，曾令兵，范玉顶，徐进，马杰，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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