单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种单纯疱疹病毒Ⅱ型ＤＮＡ疫苗。本发明专利技术应用分子克隆等基因工程技术，从单纯疱疹病毒Ⅱ型ｓａｖ株糖蛋白Ｄ基因中，分离克隆出截短糖蛋白Ｄ基因Ａｒｇ９２－Ａｌａ３０２，与真核表达载体ｐＶＡＸ１连接构建成截短糖蛋白Ｄ基因ＤＮＡ疫苗１；与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３连接构建成截短糖蛋白Ｄ基因ＤＮＡ疫苗２。这两种截短糖蛋白Ｄ基因ＤＮＡ疫苗，均可诱导被免疫机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒Ⅱ型感染，解决单纯疱疹Ⅱ型感染反复复发的严重问题。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药
，具体地说是涉及一种DNA疫苗。
技术介绍
生殖器疱疹的病原体是单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)。单纯疱疹病毒，是一种DNA病毒，人类是单纯疱疹病毒的唯一自然宿主。单纯疱疹病毒可分为I型(HSV-1)及II型(HSV-2)两种。单纯疱疹II型感染临床表现为生殖器疱疹(GH)。亚临床感染、无症状排毒、未识别症状及不典型患者是GH的主要传染源。大多数将疾病传染给性伴侣的生殖器HSV感染者通常并不知道自己感染了HSV。有临床症状或皮损时，传染性强；无症状感染者及复发性GH的复发间歇期也可能排毒，有传染性。HSV感染引起的GH往往呈慢性复发过程，尚无彻底治愈的方法。即使早期治疗初发感染，也不能阻止潜伏期感染或预防复发。目前临床上所有用药，仅能起到以下几方面作用1)减少严重初发感染的病毒扩散和症状；2)勉强地减少复发病例的病毒扩散和症状；3)治疗免疫受损病人的慢性感染；4)预防性应用，减少复发率。目前尚无特效药物控制单纯疱疹病毒的发生和复发。因而DNA疫苗成为国内外研制抗HSV感染的热点。目前国内外主要是将多克隆全长，或去除信号肽的HSV-1、HSV-2糖蛋白D基因，与普通真核表达载体pcDNA3或其衍生系列等连接构建DNA疫苗。其构建成功的糖蛋白D基因DNA疫苗表现为能激发体液免疫，但对细胞免疫的诱导能力弱。而在单纯疱疹II型感染中，细胞免疫扮演了重要角色。由于目前国内外构建的糖蛋白D基因DNA疫苗无法诱导强大的细胞免疫，因而不能有效预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服以上问题提供具有预防和治疗作用的单纯疱疹病毒II型DNA疫苗。本专利技术从单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因的克隆测序出发，与Gene Bank中单纯疱疹病毒II型糖蛋白D基因序列比较分析，BIMAS、SYFPEITHI软件分析糖蛋白D基因全长氨基酸序列，确定糖蛋白D基因上CTL表位和抗原保护性片段，截取基因Arg92-Ala302克隆到真核表达载体pVAX1，构建截短糖蛋白D基因DNA疫苗1；在体内、体外实验结果上进一步克隆截短糖蛋白D基因Arg92-Ala302和真核表达载体pcDNA3构建截短糖蛋白D基因DNA疫苗2。两种截短糖蛋白D基因DNA疫苗，均可诱导被免疫机体产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染，解决单纯疱疹II型感染反复复发的严重问题。本专利技术用以构建真核表达载体的基本骨架为pVAX1和pcDNA3。pVAX1购自invitrogen公司，序列和物理谱图见该公司的产品目录。pcDNA3购自invirtrogen公司，序列和物理谱图见该公司的产品目录。插入的外源基因Arg92-Ala302来源于单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因，其结构描述如下所示(1)序列特征长度676bp类型核酸链数双链几何结构线性(2)分子类型DNA(3)来源单纯疱疹病毒II型sav株，购自中国预防科学院(4)序列描述如序列表所示。本专利技术的有益效果本专利技术构建的这两种疫苗以基因枪介导方式、肌注方式免疫，能大大减少疫苗的用量，有效激发体液免疫和细胞免疫，同时具有免疫过程简单、接种安全、可重复性强等优点。附图说明图1为含截短糖蛋白D基因(Arg92-Ala302)的质粒图谱；图2为截短糖蛋白D基因DNA疫苗构建流程图；图3为豚鼠血清糖蛋白D基因DNA疫苗IgG结果图；图4为免疫豚鼠外阴平均皮损统计图；图5为小鼠脾淋巴细胞刺激指数图(d28)；图6为免疫小鼠脾淋巴细胞CTL活性图(d28)； 图7为免疫小鼠抗致死量HSV-2病毒攻击结果图。其中，附图中的gD表示糖蛋白D基因。具体实施例方式实施例1截短糖蛋白D基因DNA疫苗1的制备1、HSV-2基因组DNA的提取(1)收集≤160μL出现CPE为+++的Vero细胞上清，移入1.5mL离心管中。(2)加入3倍样品体积的BufferG-AV，漩涡震荡混合均匀，冰浴5min。(3)加入1.8倍体积的BufferG-BV，用力混合均匀。(4)将混合溶液转入Filter(置于2mL Microfuge Tube中)，12 000×g离心1min。(5)将Filter置于另一新的2mL Microfuge Tube中，吸弃上相，将下相溶液转入原滤器中，12 000×g离心1min。(6)弃Filter，在滤液中加入2倍体积的Buffer G-CV，混合均匀。(7)将Nucleic acid-prep Tube置于2mL Microfuge Tube中，将步骤(6)中的混合液加入Nucleic acid-prep Tube中，1 000×g离心1min。(8)弃滤液，将Nucleic acid-prep Tube置回到原2mL Microfuge Tube中，加入500μL Buffer W1，1 000×g离心1min。(9)弃滤液，将Nucleic acid-prep Tube置回到原2mL Microfuge Tube中，加入700μL已加无水乙醇的Buffer W2，1 000×g离心1min，以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次。(10)将Nucleic acid-prep Tube置于1.5mL离心管中，12 000×g离心1min。(11)将Nucleic acid-prep Tube置于另一洁净的1.5mL离心管中，在silica膜中央加入40μL Eluent或去离子水，室温静置1min。12 000×g离心1min洗脱DNA。2、全长糖蛋白D基因的PCR扩增(1)特异性引物P1、P2的稀释P1核酸序列5′-AAATACGCCTTAGCAGACCCCT-3′P2核酸序列5’-CTAGTAAAACAATGGCTGGTGC-3’分别以500μL双蒸水溶解上下游引物，得到浓度约为20μmol/L的引物溶液。计算公式如下分子量＝碱基数×324.5。质量数＝OD值×33。摩尔数＝质量数/分子量。添加的水体积＝摩尔数/所要的摩尔浓度。(2)PCR反应体系10×PCR Buffer 5μLHSV-2基因组模板DNA 5μL10mmol/L dNTP Mix 1μL上游引物P1(20pmol/L)1μL下游引物P2(20pmol/L)1μL无菌双蒸水 36.75μLQIAGEN Taq DNA Polymerase 0.25μL总体积 50μL(3)PCR扩增条件第一步，96℃变性10min。第二步，按下列参数重复35个循环，94℃变性1min，65℃退火2min，72℃延伸2min。第三步，65℃退火5min，72℃延伸5min。冷至室温。PCR产物经胶纯化。3、PCR产物的纯化(1)在紫外灯下，用干净、锋利的解剖刀将DNA片段从琼脂糖凝胶中切出。(2)无色小管中称胶块重。按每1μg胶块加3μL加入Buffer QG。(3)50℃水浴10min(或直到胶块全部熔解)，期间每隔2～3min可漩涡振荡助熔。(4)胶块熔解完全后，目测混合物的颜色是否为接近于Buffer QG的黄色。(5)将QIAquick spin柱放入提供的收集管中。(6)将样品移入QIAquick 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单纯疱疹病毒Ⅱ型ＤＮＡ疫苗，包括真核表达载体和截短糖蛋白Ｄ基因，其特征在于所述截短糖蛋白Ｄ基因为Ａｒｇ９２－Ａｌａ３０２，来源于单纯疱疹病毒Ⅱ型ｓａｖ株糖蛋白Ｄ基因，Ａｒｇ９２－Ａｌａ３０２基因的核苷酸序列如序列表所示。

【技术特征摘要】
1.一种单纯疱疹病毒II型DNA疫苗，包括真核表达载体和截短糖蛋白D基因，其特征在于所述截短糖蛋白D基因为Arg92-Ala302，来源于单纯疱疹病毒II型sav株糖蛋白D基因，Arg92-Ala302基因的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨慧兰，
申请(专利权)人：广州军区广州总医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]