制备减毒水痘-带状疱疹病毒疫苗的方法技术

以较高的ＶＺＶ产量制备活的减毒水痘－带状疱疹病毒疫苗。该新方法使活ＶＺＶ疫苗的大量制备更为实用。另外，最佳单层细胞培养条件提供了一种提高单层细胞密度的方法，该方法可用于提高病毒疫苗的产量。根据该方法，在常规培养容器中通常获得接近５００，０００个细胞／ｃｍ↑［２］的细胞密度。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起水痘和带状疱疹。水痘是一种发生在无VZV免疫性个体上的高度传染性疾病。90%以上的人口在生命的头二十年间受到传染。该疾病严重威胁免疫抑制者和成年人。在许多病例中，VZV潜伏于背根神经节细胞中。VZV从潜伏态重新激活时则出现了带状疱疹，这是一种痛苦的慢性病。通过免疫接种预防水痘是人们期望的目标，预计将实现用活的减毒水痘疫苗进行普遍的儿童免疫接种。现有技术已报道了VZV在各种细胞培养系统中的繁殖以及将活的减毒无细胞VZV用作为疫苗。美国专利3，985，615描述了在豚鼠的初生胚细胞中制备适于用作疫苗的减毒的VZVOka株。美国专利4，008，317描述了在WI-38细胞中培养VZV的温度敏感性突变体以用作为疫苗稳定剂。用于维持活VZV的组合物如SPGA，也是本领域内已知的。VZV疫苗的商品化生产受到的主要限制是从本领域内已知的细胞培养系统中获得无细胞VZV的产量。使用本专利技术的新方法可以将无细胞VZV的产量提高约5-20倍。因此，本专利技术是一种高产量地制备活的减毒无细胞VZV疫苗的方法。通常，本领域已知的单层细胞培养方法产生约80，000至160，000个细胞/cm2。这些单层培养物只能生长到有限的密度，因而阻碍了用单层细胞培养物生产病毒抗原。过去提高细胞培养物密度的努力已转向用专门的灌注培养容器将饱和密度提高到约1×106个细胞/cm2。本专利技术提供了独特的提高细胞产量的方法，但使用了现存的细胞培养系统。本专利技术提供了一种方法，它可以使附着细胞生长至比迄今为止可能达到的密度高得多的密度，从而使在用于生产疫苗的细胞单层上培养的病毒达到更高的产量。本专利技术涉及用于单层细胞培养的新方法以及在该方法中使用的新组合物。该方法需要使用与基本培养基不同的加富培养基，并在该加富培养基中补充最适浓度的类脂。根据本专利技术方法，使用含有SRFE-2并补充了约0.02-0.4g/ml大豆类脂的新生长培养基，可使单层细胞培养密度大大提高。由此获得的提高了密度的单层细胞可用于改进病毒抗原的生产以制备抗病毒疫苗。当用于制备特定疫苗时，本专利技术是一种用于生产大批量可用于预防水痘的活的减毒无细胞VZV疫苗的方法，该方法包括在使VZV产量和稳定性最高的条件下，在细胞培养物中最适地繁殖VZV并收集该病毒。该最佳方法的步骤包括a.利用大培养体积或加富培养基，并供应不能代谢的二糖如蔗糖，将选自人二倍体细胞如MRC-5的VZV易感染细胞在单层培养中培养至会合;b.在尽可能接近会合点时，用实用范围内尽可能高感染复数的VZV感染细胞感染步骤(a)培养的细胞;c.将VZV感染培养物在高营养状态下维持约22-96小时，并在VZV产量达到峰值时收集;d.在收集VZV感染细胞前，用任选含有溶酶体营养剂如氯化铵或氯喹的生理溶液洗涤VZV感染培养物;e.将VZV感染细胞收集到最小体积的稳定溶液中，并且或者立即破碎细胞，或者冷冻这些细胞供以后破碎;f.破碎VZV感染细胞以最适地释放细胞结合的VZV，并除去细胞碎片，以提供无细胞VZV制备物。附图说明图1.在添加蔗糖的培养基中VZVPFU的产量。图2.无细胞VZV抗原的产量。图3.-20℃或4℃时VZV在SPGA稳定剂中的稳定性。图4.用不同的培养基获得的VZVPFU产量。图5.输入的细胞结合感染复数对无细胞VZV产量的影响。本专利技术涉及在单层培养中培养细胞的方法。本专利技术的目的在于提高附着培养细胞的密度。通过提供补充了最适浓度的类脂的加富生长培养基达到上述目的。通过在本专利技术的新的培养基-类脂组合物中培养本专利技术的单层培养物，可以大大提高病毒噬斑形成单位(PFU)或病毒抗原的产量。因此，使用本专利技术的细胞培养方法有益于甲型肝炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、风疹、轮状病毒、麻疹、脊髓灰质炎、流行性腮腺炎和其他病毒的疫苗。用于该方法的一种优选的加富培养基是SRFE-2(可从SIGMAChemicalCo.，St.Louis，MO，S2138或从ServaFineChemicals，Heildelberg，Germany47523购买)。Weiss等人描述了该培养基。按本文所述相同方式使用的其他等价培养基或组成略有变化的SRFE-2，是本专利技术的自然延伸。在本专利技术中使用许多已知类脂添加剂中的任何一种都具有突出优点。例如，发现成年牛血清的富含胆固醇的类脂(SIGMACHEMICALCO.catalog＃L-4646)、EX-CYTE类脂Ⅰ或极低内毒素(VLE)类脂(MILESInc.，catalog＃′s82-004-7至8和82-019-1)是有益的加富培养基添加剂。一种优选的类脂添加剂是可从BoehringerMannheimBiochemicals，IndianapolisIN，catolog＃1074482买到的大豆类脂提取物。Iscove和Melchers描述了该物质或类似物质可替代B-淋巴细胞培养中的血清。在这篇文献和BoehringerMannheim公司的产品目录中，都没有提示大豆类脂添加剂可用于添加加富培养基。按照这些文献，类脂是用作为基本培养基中的血清替代物。而在本专利技术中使用的类脂是一种加富培养基添加剂。另外，按照已公开的文献，类脂的使用浓度约为10-100μg/ml。根据本专利技术，这些类脂的最佳使用浓度比文献中或制造商建议的浓度高2-3倍。再者，本专利技术中使用的类脂添加剂在添加血清时仍可使用，而不是代替血清的添加。在本专利技术方法中，将MRC-5细胞、WI-38细胞、非洲绿猴肾异倍体细胞或另一种用于繁殖病毒的细胞类型接种在培养容器中。在本领域内已知的基本培养基如EMEM或EBME，或在加富培养基如无类脂添加剂的SRFE-2培养基中，完成起始细胞植入期。还可以供应约10%的胎牛血清(FCS)、抗生素如新霉素(约50μg/ml就足够)和L-谷氨酰胺(约2mM)。将细胞在细胞和病毒允许的温度下(通常约34-37℃，优选约35℃)，根据所要制备的病毒培养若干天。在细胞已明显地附着并在单层培养中旺盛生长之后，除去基本培养基或加富培养基，用补充了最佳浓度类脂的新鲜加富培养基替代。再培养一个阶段后，可再一次除去培养基并用不含类脂添加剂的新鲜加富培养基替代。发现在细胞已经接近或达到会合后提供类脂具有逆生产作用，会降低最大细胞产量。在准备将已培养好的单层细胞用病毒接种物感染时，除去类脂添加剂，并将病毒原种导入一批新鲜的加富培养基中。这后一批培养基不含类脂，可使细胞生长延长而不产生上面提到的类脂诱导的细胞减少问题。完成上述过程后，细胞和病毒的产量大大提高。例如，在MRC-5细胞上培养水痘病毒时，与在基本培养基或单独的SRFE-2培养基上培养MRC-5细胞时相比较，VZVPFU产量大大提高。同样，按这种新方法培养时，用于水痘生长或风疹病毒生产的WI-38细胞的生长密度要高得多。当用于生产特定疫苗时，本专利技术新方法包括在使病毒产量和稳定性最佳的条件下，在细胞培养物中繁殖VZV，并收集得到的VZV。对VZV的生产所述的优点适用于其他有被膜病毒的生产，包括除VZV以外的疱疹病毒、麻疹、流行性腮腺炎或风疹病毒的生产。本专利技术的最终目标是提供一种能有效地生产用作疫苗的VZV的方法。根据该方法的每一步骤最佳化时最终获得的无细胞V本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备活的水痘－带状疱疹病毒（ＶＺＶ）疫苗的方法，该方法包括：ａ．在足以使细胞高度复制的高营养条件下，将选自人二倍体细胞的ＶＺＶ易感染细胞培养至在单层培养物中会合，并供给不能代谢的二糖；ｂ．在尽可能接近会合点时，用实用范围内尽可能高感染复数的ＶＺＶ感染细胞感染步骤（ａ）培养的细胞；ｃ．将ＶＺＶ感染培养物在高营养状态下维持约２２－９６小时，并在感染性ＶＺＶ产量达到峰值时收集；ｄ．在收集ＶＺＶ感染细胞前，用任选含有溶酶体营养剂如氯化铵或氯喹的生理溶液洗涤ＶＺＶ感染培养物；ｅ．将ＶＺＶ感染细胞收集到最小体积的稳定溶液中，并且或者立即破碎细胞，或者冷冻这些细胞供以后破碎；ｆ．破碎ＶＺＶ感染细胞以最适地释放细胞结合的ＶＺＶ，并除去细胞碎片，以提供无细胞ＶＺＶ制备物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PJ普罗沃斯特，DL克拉，PA弗里曼，
申请(专利权)人：麦克公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]